逍遥散对慢性束缚应激肝郁脾虚证模型大鼠SP、VIP基因表达的影响*

2014-02-08 22:43李晓红谢宇晴杨力强
中国中医基础医学杂志 2014年7期
关键词:杏仁核肝郁脾虚

李晓红,梁 媛,谢宇晴,黎 强,杨力强△

(1.广西中医药大学,南宁 530001; 2.中国中医科学院中医基础理论研究所, 北京 100700)

肝郁脾虚证是肝失疏泄、脾失健运所致的中医证候。近年来很多学者从脑肠互动角度认识肝郁脾虚证的病理机制,脑肠肽同时分布于中枢神经系统和胃肠道,是反映脑肠互动的关键因素。逍遥散始载于《太平惠民和剂局方》,由柴胡、白术、白芍、生姜、甘草、薄荷、茯苓、当归8味药物组成,是调和肝脾的代表方。本实验通过慢性束缚应激[1]方法制作肝郁脾虚证大鼠模型,观察模型大鼠中枢海马、杏仁核和外周胃、结肠组织中脑肠肽SP、VIPmRNA表达的变化及逍遥散的调节作用,为肝郁脾虚证的脑肠互动机制及逍遥散的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

SD雄性大鼠30只,体质量(200±20)g,购自广西医科大学动物实验中心,适应性饲养1周后按体质量随机分为正常对照组、模型组、逍遥散组,每组各10只。动物每笼5只群养,光照节律12L∶12D (6∶00~18∶00),饲养于普通级动物房,室内温度保持为(22±2)℃,相对湿度保持为30%,大鼠喂常规饲料及饮用水。

1.2 中药及制备

实验所用中药复方选用《太平惠民和剂局方》中的逍遥散(柴胡30 g,当归30 g,白芍30 g,白术30 g,茯苓30 g,炙甘草15 g,生姜10 g,薄荷10 g),中药饮片购自广西中医药大学附属瑞康医院,用水煎成汤剂,浓缩至含生药量1.67 g/ml,4℃冰箱保存。

1.3 仪器与试剂

PCR仪为ABI7500 Real-Time PCR System,RNA提取试剂盒Trizol、反转录试剂盒SuperScript III Reverse Transcriptase由Invitrogen公司提供,PCR 试剂盒SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)由Takara公司提供。

1.4 模型制备及药物干预

将模型组和逍遥散组大鼠进行捆绑束缚造模,随机选取束缚时间点,每日3 h, 连续21 d。正常对照组大鼠不予束缚,自由进食、饮水及自主活动。自造模第1天开始,每日在束缚前1 h给各组大鼠灌胃,逍遥散组大鼠灌服逍遥散中药煎液,根据成人逍遥散每日用量,按体表面积换算成大鼠用药量为16.7 g/(kg·d),灌胃容积为1 ml/100 g体质量,正常组、模型组大鼠每日灌服同等换算量的生理盐水。造模期间根据大鼠体质量调整给药量。

1.5 取材

造模21 d结束后取材标本,各组大鼠用10%的水合氯醛腹腔注射进行深度麻醉(0.4 ml/100 g体质量),将大鼠断头,取海马、杏仁核和胃(胃窦组织距幽门0.5 cm处)、结肠组织(距肛门7~10 cm处),胃、结肠组织用预冷的生理盐水冲洗处理,所有标本放入液氮速冻后移入-80℃低温冰箱中保存备用。

1.6 检测

实时荧光定量PCR法检测海马、杏仁核、胃、结肠组织SP、VIP表达

1.6.1 组织总RNA提取 按照Trizol试剂盒方法提取海马、杏仁核、胃、结肠组织总RNA ,把提取的总RNA 用1%琼脂糖凝胶电泳进行电泳,观察其完整性。NanoDrop 8000分光光度仪测定总RNA的浓度和纯度,所有样品的A260/A280比值均在1.83~2.03范围之间,满足实验要求。总RNA 于-80℃保存备用。

1.6.2 PCR引物序列设计 引物由ABI Primer Express v 2.0软件设计,序列由生工生物工程有限公司合成。引物序列如下: SP(forward: 5’ATCGGTGCCAACGATGATCT3’, reverse:5’CCGTTTGCCCATTAATCCAA3’,150 bp),Vip(forward: 5’CCAGAAGGAAAGACCCAAGGA3’ reverse:5’CCTGTCATCCAACCTCACTGAA3’,150 bp),GAPDH(forward: 5’AGGAGTCCCCATCCCAACTC3’, reverse:5’TTTTGAGGGTGCAGCGAACT3’, 140 bp)。

1.6.3 RNA反转录合成cDNA 采用20 μL反应体系,取总RNA5μg,加入Random primer 1 μl,dNTP (10 mM) 1 μl,加入ddH2O使总体积达到13 μl,混合后65℃加热5 min,立即冰浴1~2 min;加入5×First strand buffer 4 μl,0.1 M DTT 1 μl,RNaseOUT 1 μl,SuperScript III RT 1 μl,充分混匀,25℃孵育5 min;50℃孵育60 min;70℃加热15 min,以灭活SuperScript III RT。

1.6.4 实时- 荧光定量PCR反应 按照SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)试剂盒操作说明进行实时荧光定量PCR检测,通过收集荧光强度信号的变化来检测循环阈值(cycle threshold, Ct),由ABI7500 Real-Time PCR System监测。20 μl反应体系组成为SYBR Premix Ex Taq II(2X) 10 μl、引物各0.8 μl、ROX reference dye II (50 X) 0.4 μl、 cDNA模板0.25 μl、加入ddH2O补足至总体积20 μl。反应条件:第1步:预变性95℃ 1min;第2步:变性95℃ 10 s, 60℃ 32 s,40个循环;第3步:溶解曲线,95℃ 15 s,60℃ 1 min,95℃ 15 s,60℃ 15 s,终止反应,降温至 4℃。SP、VIP mRNA的表达用2-△△Ct计算其相对表达量[2]。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠海马、杏仁核、胃、结肠组织SPmRNA表达的变化

表1显示,与正常对照组比较模型组大鼠海马、结肠组织SPmRNA表达显著升高(P<0.01),杏仁核、胃组织SPmRNA表达无明显变化;与模型组比较逍遥散组大鼠海马、结肠组织SPmRNA表达显著降低(P<0.01),杏仁核SPmRNA表达略降低(P>0.05),胃组织SPmRNA表达无明显变化。

表1 各组大鼠海马、杏仁核、胃、结肠组织SPmRNA表达的变化

注:与正常组比较:▲P<0.05,▲▲P<0.01;与模型组比较:*P<0.05,**P<0.01

2.2 各组大鼠海马、杏仁核、胃、结肠组织VIPmRNA表达的变化

表2显示,与正常对照组比较模型组大鼠海马VIPmRNA表达显著升高(P<0.01),杏仁核、胃组织VIPmRNA表达显著降低(P<0.01或P<0.05),结肠组织VIPmRNA表达有下降趋势(P>0.05);与模型组比较,逍遥散组大鼠海马VIPmRNA表达显著降低(P<0.01),杏仁核、胃组织VIPmRNA表达显著升高(P<0.01或P<0.05),结肠组织VIPmRNA表达升高,但差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组大鼠海马、杏仁核、胃、结肠组织VIPmRNA表达的变化

注:与正常组比较:▲P<0.05,▲▲P<0.01;与模型组比较:*P<0.05,**P<0.01

3 讨论

脑肠肽不仅存在于胃肠道内分泌细胞、肠神经系统(ENS),也存在于中枢神经系统(CNS)中,脑肠肽可通过体液途径或作为肠道神经系统递质在外周对胃肠运动功能进行调节,还可通过影响迷走神经环路在中枢水平发挥作用[3],对胃肠功能、人类情感、行为等产生影响[4],是认知和情感中枢与神经内分泌、肠神经系统和免疫系统相联系的双向交通通路的分子基础[5]。脑肠肽的增多和减少可引起胃肠道、免疫、神经功能失调而致疾病发生。SP、VIP是两种重要的脑肠肽,在探寻胃肠动力变化的物质基础中研究较多[6,7]。

SP为速激肽家族中含11个氨基酸残基的多肽,在全身均有分布,以胃肠道和中枢神经系统浓度最高。SP在中枢和外周神经系统均为兴奋性神经递质,一般认为SP是一种传递伤害性信息的神经肽。在ENS中, SP可增加胃肠蠕动,有强烈促消化道平滑肌收缩、加强结肠的集团推进运动、刺激小肠、结肠黏膜分泌水和电解质作用[8],还可刺激内脏血管扩张并介导内脏疼痛[9], 发挥使肥大细胞释放组胺、浆液外渗、影响巨噬细胞和白细胞等外周生理调节作用[10],是一种主要的促炎症性感觉性神经肽[11]。脑内SP参与感觉、运动和情绪等调节,并与焦虑症、抑郁症等精神疾病的发病机理有关[12]。SP能引起正常人产生与抑郁症病人相似的情绪,导致睡眠和神经内分泌的改变,临床上重症抑郁症病人血浆SP的循环水平升高,抗抑郁剂治疗使之含量达到正常[13]。

VIP是一种含28个氨基酸残基的碱基多肽, 属于促胰液素-胰高血糖素家族,因其有明显的扩张血管作用而被命名为血管活性肠肽。VIP作为胃肠动力抑制性神经元,可引起胃容受性舒张,能抑制胃酸分泌, 松弛胃肠道平滑肌, 抑制结肠和直肠的紧张性。在中枢中,VIP与引起觉醒效应、提高体温、摄食睡眠有关。近年来的研究表明,VIP可刺激垂体细胞分泌促肾上腺皮质激素(ACTH)而起到类似促皮质激素释放激素(CRH)的作用,参与ACTH分泌的调节[14]。而Barazmji 等人发现,将ACTH注入侧脑室对饥饿大鼠或自由摄食鼠能起到抑制食欲的作用[15]。VIP还能抑制促炎细胞因子的释放,同时提高机体抗炎因子水平,维持促炎-抗炎因子水平[16]。

本次研究显示,模型组大鼠SP、VIPmRNA表达在中枢和外周出现了异常分布,SP在海马和结肠组织显著升高,VIP在海马显著升高、杏仁核和胃组织显著降低。实验过程中观察到,模型组大鼠出现情志抑郁、焦虑、饮食减少、体质量减轻、倦怠乏力、排便次数增加及大便稀软等症状表现,可能与海马SP、VIP和结肠组织SP的表达升高有关。 VIP在胃组织显著降低,一方面可能由于促进了促炎细胞因子的释放和增强了胃黏膜血管的收缩,从而使我们在实验过程中不仅肉眼观察到模型组大鼠胃部黏膜出现瘀血、水肿,光学显微镜下胃部黏膜中也见到大量的炎症细胞渗出[17];另一方面可能导致对胃的抑制作用减弱或消失,使胃出现过度的蠕动,胃的紧缩甚至痉挛则使有效的推动性运动减弱,也可能是加重肝郁脾虚证大鼠食欲下降的原因。上述实验结果还显示,逍遥散能降低海马、结肠组织SP表达及海马VIP表达,升高杏仁核和胃组织VIP表达,表明逍遥散对中枢和外周SP、VIP的变化都有调节作用。

综上所述,课题组认为临床上肝郁脾虚证病人表现出精神情志异常,以及出现纳呆、嗳气、脘腹痛、腹胀、腹泻等消化不良症状,可能与中枢和外周SP和VIP的变化有关,SP、VIP可能参与了肝郁脾虚证脑肠互动机制,但仅仅SP、VIP的变化是不能完全解释肝郁脾虚证患者的临床表现的,必定有众多的脑肠肽参与肝郁脾虚证这一病理演变过程。近年来,系统生物学技术在中医证候的研究中已得到广泛的应用[18],今后计划借鉴系统生物学技术平台对肝郁脾虚证及逍遥散进行深入研究,将有利于从整体上阐明肝郁脾虚证的脑肠互动机制及逍遥散治疗肝郁脾虚证的作用机制。

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