消风宣窍汤对TDI致过敏性鼻炎模型豚鼠血清IL－5、IL－12表达水平的影响

李 萌 魏肖云 汪受传

（南京中医药大学，南京，210029）

消风宣窍汤对TDI致过敏性鼻炎模型豚鼠血清IL－5、IL－12表达水平的影响

李 萌 魏肖云 汪受传

（南京中医药大学，南京，210029）

目的：观察消风宣窍汤对过敏性鼻炎豚鼠行为学及细胞因子的影响，以探讨其治疗机制。方法：40只Hartley豚鼠随机分为正常组、模型组、消风宣窍汤组、氯雷他定组，每组10只。采用10%二异氰酸甲苯酯（TDI）橄榄油溶液致敏豚鼠建立过敏性鼻炎动物模型，灌胃治疗1周，观察豚鼠行为学变化，用ELISA法测定血清中细胞因子IL－5、IL－12含量。结果：消风宣窍汤能明显减轻豚鼠过敏性鼻炎鼻部过敏症状以及鼻黏膜上皮炎细胞的浸润，对过敏性鼻炎豚鼠血清IL－5有显著的降低作用（P＜0.01），对IL－12有显著的升高作用（P＜0.01），两者呈负相关关系，并且效果优于开瑞坦组（P＜0.05）。结论：消风宣窍汤治疗AR的机制可能是通过降低IL－5和升高IL－12水平实现的，提示IL－5和IL－12在AR发病机制中有重要作用。

消风宣窍汤；过敏性鼻炎；细胞因子；行为学

过敏性鼻炎（Allergic Rhinitis，AR）是儿科常见的呼吸道疾病，近年来发病率逐年增多，影响儿童的学习和生活质量。免疫学研究表明，体T细胞系列中的Th细胞及其分泌的细胞因子失衡在变应性鼻炎的发病中起重要作用[1]。近年来相关的临床研究表明中医药治疗本病具有一定的优势[2－3]。本研究从形态学及分子生物学角度观察消风宣窍汤对豚鼠AR模型的药理作用机制，以期为其临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物 幼年Hartley豚鼠40只，雌雄各半，体重（200±25）g，清洁级，由南京中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（苏）2007－0008。饲养条件：室温（23±2）℃，相对湿度（60±5）%，自由摄取水和食物，单笼饲养，每笼5只，保持室内安静。适应性饲养1周后开始正式实验。

1.2 药品与试剂 消风宣窍汤按原方剂量要求，由南京中医药大学附属百草堂门诊中药房提供，分别加适量水，水煎2次，合并两次滤液并分别减压浓缩至生药浓度2.1 g·mL－1冷藏备用。开瑞坦（氯雷他定片）由上海先灵葆雅制药有限公司生产，规格：10 mg×6片，国药准字：H10970410，批号：10KRXF1047，用蒸馏水溶解并稀释为0.1 g·m L－1。

二异氰酸甲苯酯（TDI）由大中原联合化学（郑州）有限公司生产，批号：20120901。橄榄油由国药集团化学试剂公司生产，批号：20120730。豚鼠IL－5、IL－12酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒由美国RD公司生产，上海韵涵生物科技公司分装，批号：201304。

1.3 动物分组及造模方法 将40只豚鼠应用随机数字表法分为对照组，模型组，消风宣窍汤组，开瑞坦组，每组10只，雌雄各半。造模方法参考文献方法[4]，并作相应改进。致敏组均首先选用10%TDI橄榄油溶液用加样器滴入豚鼠双侧鼻孔（每侧5/μL），1次/d，连续7次，为基础致敏阶段；第8日起改为隔日激发给药1次，直至药物观察结束。正常对照组则以橄榄油代替。

1.4 模型判定 以鼻部症状和体征为主要观察内容。自给致敏药开始，依据鼻痒、喷嚏、流涕轻重程度、次数多少、出现的时间长短等为评分标准并评分记录，评分标准详见表1。

表1 过敏反应行为学评分表

各症状叠加积分，总分≥5分者为模型成功，观察时间为每次致敏后3 min内。

1.5 给药方法 AR模型建立后，将药品按人鼠剂量换算后按20 mL·L－1灌胃，2次/d，共7 d。正常组、模型组予生理盐水灌胃；消风宣窍汤组分别以生药浓度2.1 g·mL－1药汁灌胃；开瑞坦组予开瑞坦0.1 g· mL－1浓度混悬液灌胃。给药期间记录鼻部症状，以观察药物治疗后豚鼠鼻部情况。

1.6 观察项目

1.6.1 鼻部症状观察 采用症状叠加积分（见模型判定），比较组间差异。

1.6.2 血清IL－5、IL－12含量的测定 豚鼠于末次激发后30 min，用25%乌拉坦腹腔注射麻醉（4 m L· kg－1），颈动脉插管采取5 mL，离心（3 000r/min）10 min后分离出血清，于－70℃保存，避免反复冻融。取血清标本，按照试剂盒所示方法（ELISA法）检测血清IL－5、IL－12含量。

2 结果

2.1 鼻部症状的改善 第1次鼻腔激发后豚鼠即出现不同程度的搔鼻、流涕症状，随着激发次数的增多，上述症状加重，并出现不同程度的喷嚏症状。给药7 d后，模型组总积分（6.143±0.378）分（见表2）。用药后致敏组豚鼠，模型对照组的症状与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；消风宣窍汤组的症状与模型对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；开瑞坦组的症状与模型对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。（见表3）

实验过程中，除正常组外，其余3组均有豚鼠陆续死亡，其中2只为豚鼠造模过程中不明原因死亡，解剖尸体未发现明显异常；6只为造模后鼻塞明显，出现气喘惊厥症状，窒息死亡。治疗结束后各组豚鼠数量如下：正常组10只；模型组7只；消风宣窍汤组8只；开瑞坦组7只。各组豚鼠死亡数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表2 鼻部激发症状评分结果

表3 消风宣窍汤治疗期间各组症状得分对照

2.2 鼻黏膜病理切片观察 HE病理切片显示：正常组见纤毛密集，排列整齐（图1）；模型组见纤毛大部分脱落、变稀，排列紊乱，杯状细胞增生明显，固有层血管扩张，腺体增生，组织水肿，伴有大量炎性细胞浸润等（图2）；消风宣窍汤组见纤毛增生，排列较整齐（图3）；开瑞坦组见纤毛部分脱落、变稀，但较模型组稍好（图4）。

2.3 血清IL－5、IL－12的变化 与正常组相比，模型组的IL－5水平显著上升（P＜0.01）；与模型组相比，消风宣窍汤组与开瑞坦组IL－5水平较模型组显著下降（P＜0.01）；与正常组比较，模型组的IL－12水平显著下降（P＜0.01），与模型组相比，消风宣窍汤组IL－12水平较模型组显著上升（P＜0.01），开瑞坦组IL－12水平较模型组明显上升（P＜0.05）。（见表4）

表4 用药后各组症状累计总积分及血清IL－5、IL－12水平变化（±s）

表4 用药后各组症状累计总积分及血清IL－5、IL－12水平变化（±s）

注：与正常对照组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别例数症状总积分IL－5（ng/mL）IL－12（pg/m L）10 0.125±0.3536 33.333±3.252 17.029±1.003模型组7 6.429±0.976△△61.653±0.621△△8.100±1.538△△消风宣窍汤组8 3.250±1.708**37.003±1.094**14.648±1.497**开瑞坦组7 4.857±1.069 43.973±11.590**10.584±0.582正常组*

2.4 IL－5和IL－12相关性 采用Person秩相关检验，r＝－0.867，P＝0.000，说明此两项指标呈负相关关系。

3 讨论

AR属于中医学“鼻鼽”范畴，以鼻痒、阵发性喷嚏、大量清水样鼻涕和鼻塞为主要临床表现。传统观念认为本病的发生与外界因素密切相关，内因以脏腑虚损为主，但与个人禀赋体质有关[4]。汪受传教授认为，在小儿鼻鼽的发病中，风邪是主要的致病邪气，风痰束窍为其主要病机[5]。临证中善用风药治疗本病，消风宣窍汤是汪受传教授治疗小儿鼻鼽的有效验方，由炙麻黄、桂枝、防风、辛夷、苍耳子、五味子、乌梅、胆南星、广地龙等组成，具有消风化痰、宣肺利窍之功效。该方具有中医理论及现代药理基础[6]，临床疗效确切。本课题组前期研究表明消风宣窍汤干预后能降低AR豚鼠血清IL－6、IL－17水平，从而减少炎性细胞的浸润和活化，抑制IgE的合成与分泌[7]。

本文参照文献方法建立了豚鼠TDI变应性鼻炎模型，动物出现抓鼻挠面、喷嚏、鼻黏膜充血肿胀、炎性细胞浸润等表现，消风宣窍汤干预后能明显改善上述症状，并减轻鼻黏膜病理改变，结果与文献报道基本一致[8]。但本次TDI造模方法豚鼠死亡率较高，考虑与药物剂量过大及豚鼠幼小不能耐受有关。本研究表明，消风宣窍汤能明显降低豚鼠TDIAR模型症状评分和减轻鼻黏膜病理程度，表明消风宣窍汤对AR可能具有一定治疗作用。

现代医学认为，AR是机体在特异性变应原的诱导下发生的Ⅰ型变态反应性疾病。目前认为T辅助细胞（Th）及相关细胞因子产物在AR的发生发展中起关键作用。Th1/Th2细胞免疫失衡可能是导致AR发病的重要免疫学基础，即Th2主导的炎症性疾病[9]，表现为Th1细胞分泌的IFN－γ/TNF－β和IL－12等减少，对变态反应的负向调节作用减弱；Th2细胞分泌的IL－4、IL－5和TGF－β等增加，对变态反应起到正向调节作用，导致炎症发生[10]。IL－12主要由单核细胞产生，作为Th1细胞重要的细胞因子，IL－12具有多功能的免疫调节作用，与AR发生发展密切相关，能抑制特异性IgE的产生，在各个环节对AR发病都可能起到一定的调节作用[11]，IL－12在Th细胞亚群的分化中起着关键作用[12]，可有效抑制或逆转Th细胞向Th2细胞亚群的分化，是抗呼吸道变态反应性疾病的重要因素[13]，并可直接抑制多种Th2型细胞因子如IL－4、IL－5、IL－10等生成，促进Th1型细胞因子IFN－γ及IL－2产生，增强Th1细胞的免疫应答，被认为是促使T辅助细胞向Th1分化的始动因素[14]。IL－5是由T细胞、单核细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞等产生，可协同IL－4刺激B细胞合成IgE，被认为是嗜酸性粒细胞（EOS）重要的活化因子。所以降低IL－5含量、升高IL－12含量是治疗AR有效途径之一[15]。本研究通过检测各组豚鼠血清IL－5、IL－12含量的变化，发现消风宣窍汤干预后，Th2细胞因子IL－5水平较模型组明显下降，Th1细胞因子IL－12水平较模型组明显升高，且差异有统计学意义。提示消风宣窍汤可能诱导Th1细胞分化、成熟，促进其细胞因子IL－12的表达，抑制Th2细胞分化、成熟及其细胞因子IL－5的产生；促进Th1/Th2细胞趋向平衡，对AR产生治疗作用。

本研究还显示，随着血清IL－5水平的下降，IL－12水平则呈逐渐升高趋势，无论是模型组还是给药干预组，两者之间存在明显的负相关关系，但是中医药治疗本病的机理是多靶点多效应的，本次所检测的指标仅是其治疗机制的一个方面，消风宣窍汤对AR豚鼠免疫功能调节的具体机制尚有很多问题不清楚，有待于进一步研究和探索。

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（2013－12－23收稿 责任编辑：曹柏）

E ffect of X iaofeng Xuanqiao Decoction on Expression of Serum IL-5 and IL-12 in A llergic Rhinitis M odels Induced by TDI

LiMeng，Wei Xiaoyun，Wang Shouchuan
（Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210029，China）

Objective：To study the influence of Xiaofeng Xuanqiao decoction on behavior and cytokines in allergic rhinitismodels，and exp lore the therapeutic mechanism.Methods：Forty guinea pigs were randomized into 4 groups，normal control group，allergic rhinitis（AR）group，Xiaofeng Xuanqiao decoction group，and loratadine group.Allergic rhinitis models of guinea pigs were made by 10% TDI.Xiaofeng Xuanqiao decoction and loratadinewere applied to inAR guinea pigs.The serum levels of IL-5 and IL-12 were determined by ELISA methods.Results：Xiaofeng Xuanqiao decoction could obviously relieve the hypersensitivity and infiltrate the inflammatory cells on the nasalmucosa.The serum level of IL-5 in Xiaofeng Xuanqiao decoction group significantly decreased compared with that of AR group（P＜0.01），and the serum level of IL-12 in Xiaofeng Xuanqiao decoction group significantly increased（P＜0.01）.There is a positive correlation between them.The therapeutic effect of Xiaofeng Xuanqiao decoction group was better than that of loratadine group.Conclusion：The therapeutic mechanism of Xiaofeng Xuanqiao decoction on allergic rhinitis is decreasing the level of IL-5 and increasing the level of IL-12，which suggests that IL-5 and IL-12 are important factors in the pathogenesis of AR.

Xiaofeng Xuanqiao decoction；Allergic rhinitis；Cytokine；Behavior

R－332；R285.5；R276.1

A

10.3969/j.issn.1673－7202.2014.07.026

江苏高校优势学科建设工程资助项目－南京中医药大学中医学一级学科“汪受传名师名医工作室”项目（编号：苏政办发〔2011〕6号）

李萌（1987—），女，山东潍坊人，硕士研究生，研究方向：小儿肺系疾病

汪受传（1946—），男，硕士学位，教授，博士生导师，主要研究方向：小儿肺脾系疾病研究、中医药标准化研究，E－mail：wscnj＠126.com