左乙拉西坦对致痫大鼠海马组织中BMP4表达的影响

王一川，穆国军,王 影

(佳木斯大学附属第一医院儿内二科，黑龙江 佳木斯 154003)

癫痫(epilepsy,EP)是一种慢性疾患，是儿童神经系统疾病中的常见病，其特点是大脑神经元反复发作性异常放电，可突然、阵发、反复发作的一组临床综合征。癫痫的发病率与年龄有一定的关系，婴幼儿时期是患病率最高的，反复的癫痫发作严重影响患儿的健康和生活质量[1]。有研究表明，早发性癫痫，可能会导致智力能力和特定的认知功能受损，如意识、运动功能等[2]。目前，国内治疗癫痫的方法，主要依赖于长期的药物治疗。左乙拉西坦是一种新型抗癫痫药物，与其他的抗癫痫药作用机制较复杂，有研究资料表明：癫痫可导致海马组织中的BMP4表达，但左乙拉西坦对海马组织中的BMP4表达的影响国内外尚无研究报道，本课题将对此进一步探索。

1 材料与方法

1.1 动物分组

将116只Wistar大鼠随机分为：盐水组(NS组)24只、左乙拉西坦对照组(LEV对照组)24只、模型组(PILO组)34只、模型组+左乙拉西坦组(LEV治疗组)34只。

1.2 主要的实验试剂

氯化锂，匹罗卡品 ( Sigma公司 )，左乙拉西坦( UCB S.A.Belgim 公司 ) , RT PCR 试剂盒、引物合成(北京华迈科生物技术有限公司)。

1.3 模型制作

参照相关文献[3]的模型制作，具体操作步骤如下:按顺序测量每只大鼠体重，随机分组标记并记录，取PILO组和LEV治疗组，先将氯化锂溶于灭菌注射用水(10mg/mL)，按125mg/kg对大鼠进行腹腔注射,16h后，以1mg/kg的硫酸阿托品对大鼠腹腔注射，拮抗外周胆碱能反应，30min后，腹腔注射匹罗卡品60mg/kg，观察大鼠的情况，影像学记录，如果没有出现大鼠癫痫持续状态，应每隔30min重复腹腔注射匹罗卡品1次, 再次应用匹罗卡品剂量减小至15mg/kg，直至出现Ⅲ级以上癫痫持续发作,始终不出现Ⅲ级以上癫痫发作的大鼠不应纳入本实验，但如果大鼠癫痫发作持续15min以上，立即予以10%的水合氯醛3mL/kg腹腔注射，以终止癫痫发作。对NS对照组和LEV对照组，每次对大鼠进行腹腔注射等量生理盐水。大鼠癫痫发作的评分标准采用国际Racine分级：即0级:无惊厥发作;Ⅰ级:耳面部抽搐;Ⅱ级:耳面部抽搐+节律点头,但无直立位;Ⅲ级:肌阵挛,伴前肢站立;Ⅳ级:全身强直阵挛发作;Ⅴ级:全身强直阵挛发作+失去体位控制。LEV对照组和LEV治疗组，将左乙拉西坦片溶解于灭菌注射用水中(10mg/mL)，对大鼠灌胃，剂量为200mg/kg；对NS组、PILO组，予等量生理盐水进行灌胃，均每天一次，连续灌胃3周。

1.4 采集标本与测定

组织切片与取材，提取海马组织。分别于模型制作的第1、2、3周，乙醚罐中放入大鼠，吸入高浓度乙醚达到麻醉状态时，断头活杀，迅速剪开大鼠的颅骨以取出海马组织，存入实验室-70℃冰箱内保存，待所有样本集全，做提取mRNA准备。

1.5 RT-PCR测定BMP4的表达

将海马组织加入Trizol液提取总mRNA,进行逆转录合成cDNA。将cDNA产物进行RT-PCR循环。设计BMP4和GAPDH实验引物序列，引物由天津意源达生物试剂有限公司合成，PAGE纯化。β-actin为内参，β-actin上游引物：5’-CATCCGTAAA GACCTCTATGCCAAC- 3’，下游引物：5’-ATGGAGCCACCGATCCACA- 3’，扩增长度171bp;BMP4上游引物：5'-TGGACACCTCATCACACGACTA-3，BMP4下游引5'-GCGA- CGGCAGTTCTTATTCTTC-3' ，扩增长度352bp。进行PCR反应后，开始琼脂糖凝胶电泳。应用凝胶成像软件测定BMP4的表达。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 记录观察各组大鼠行为学变化

PILO模型组和LEV治疗组，在匹罗卡品腹腔注射的约5～10min，大鼠就出现癫痫发作，表现为点头、洗脸、瞳孔缩小、血泪、竖毛、流涎、排泄、跌倒、前肢阵挛、翻滚以至全面性强直阵挛发作，均出现Ⅲ级以上癫痫持续发作。在大鼠癫痫持续发作超过15min后，给予10%的水合氯醛3mL/kg腹腔注射，以终止癫痫发作。其后，LEV治疗组每日一次给予LEV200mg/kg灌胃治疗，LEV治疗组大鼠比PILO组癫痫发作及程持续时间及程度明显减少。LEV对照组与NS对照组无抽搐发作。

2.2 各组大鼠海马组织中BMP4表达

表1所示各组海马组织中BMP4-mRNA的相对表达量的比较:与NS对照组相比，各时间点的PILO模型组和LEV治疗组海马组织中BMP4-mRNA的表达水平明显升高,尤以1w升高非常显著(P<0.01)，以后逐渐降低，但仍高于NS对照组。各时间点LEV治疗组与PILO模型组相比较，LEV治疗组的BMP4-mRNA表达水平显著低于PILO模型组(P<0.01)。各时间点LEV组与NS组比较，无统计学意义(P>0.05)。见表1，图1。

表1 各组大鼠海马组织中BMP4-mRNA的相对表达量的比较

注：*与NS组比较：P>0.05；★与NS对照组比较：P<0.01；#与NS对照组比较：P<0.01；※与PILO模型组：P<0.01。

图1 RT-PCR检测各组大鼠BMP4的表达

3 讨论

癫痫是儿童时期常见的神经系统疾病之一，在婴儿及儿童时期发病率较高,2岁之前发生率约占癫痫患者总数的40%[4]。海马是大脑神经发育的最重要脑区之一，无论在胚胎时期乃至成年，海马对于短暂记忆以及学习习惯起着基本的作用[5]。很多学者研究发现，海马做为在大脑中发作阈值低的部位，是几乎所有癫痫患者发作的起始区，而且，以海马区为主的癫痫发作，长期反复发作，大多很难用药物控制[6]。研究证实，长期反复的痫性发作，可使人类神经元损伤和神经胶质细胞增生[7]。

BMP是一种多功能的生长因子，属于转化生长因子(TGF-β)超家族成员。BMP信号通过丝氨酸或苏氨酸激酶受体调节、分化，促进和培养的神经元的生长，对调节和平衡神经胶质细胞和神经元的发育，发挥重要作用[8]。研究发现，BMP与神经元损伤和神经胶质细胞电位有着密切的关系[9]。其中，BMP 4信号被报道对星形胶质细胞系增殖是必不可少的[10]。马玉新[11]等人通过用戊四氮建立癫痫大鼠模型研究发现，在模型建立的5d后BMP4免疫反应样阳性细胞显著增多并达到高峰，以后表达逐渐下降，90d后仍高于正常对照组。有研究发现，正常组大鼠海马有少量BMP4表达。在癫痫发作的3d后BMP4 mRNA表达明显增高，达到高峰，此后表达水平逐渐下降[12]。 左乙拉西坦是一种新型的第二代广谱抗癫痫药，具有易溶解和生物利用率高的化合物，不良反应少，口服几乎完全吸收。目前关于左乙拉西坦对BMP4表达尚无研究报道，本实验研究结果显示，左乙拉西坦可以抑制癫痫海马组织中BMP4的表达，从而抑制癫痫发作。

综上所述，左乙拉西坦可能是通过抑制海马组织中BMP4的表达上调，提高惊厥发作阈值，抑制星形胶质细胞系增殖，从而降低癫痫的敏感性而发挥其抗癫痫作用。本文的研究为进一步明确海马组织中BMP4表达上调及神经元可塑性在癫痫形成中发挥的重要作用提供了理论依据，更为癫痫的临床治疗提供了新的思路。

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