RP-HPLC法同时测定复方维A酸乳膏中尿囊素、维A酸、异维A酸和维生素E的含量

张志勤，李 玫，朱昌辉，王 栋，韩国柱，唐泽耀（.大连市皮肤病医院，辽宁大连 60；.大连医科大学药理教研室，辽宁大连 6044）

RP-HPLC法同时测定复方维A酸乳膏中尿囊素、维A酸、异维A酸和维生素E的含量

张志勤1＊，李 玫2，朱昌辉1，王 栋1，韩国柱2，唐泽耀2（1.大连市皮肤病医院，辽宁大连 116021；2.大连医科大学药理教研室，辽宁大连 116044）

目的：建立同时测定复方维A酸乳膏中尿囊素、维A酸、异维A酸和维生素E含量的方法。方法：采用反相高效液相色谱法。色谱柱为ODSSyncronis C18，流动相为甲醇-水-0.5%冰醋酸（梯度洗脱，采用不同的流速和检测波长），进样量为20μl，柱温为35℃。结果：尿囊素、维A酸、异维A酸、维生素E的检测质量浓度分别在125～2 000、12.5～200、6.25～100、250～4 000μg/m l范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系（r＝0.999 8、0.999 9、0.999 8、0.999 9）；精密度、稳定性、重复性试验的RSD≤0.88%；平均加样回收率分别为99.5%、97.6%、99.8%、99.0%，RSD分别为0.24%、0.97%、0.18%、0.72%（n＝6）。结论：该方法操作简便、快速、准确，适用于同时测定复方维A酸乳膏中尿囊素、维A酸、异维A酸和维生素E的含量。

复方维A酸乳膏；尿囊素；维A酸；异维A酸；维生素E；反相高效液相色谱法

维A酸类药物被广泛应用于临床皮肤科，被称为皮肤治疗学的“第三里程碑”[1]。维A酸乳膏常外用于皮肤疾病的治疗，如痤疮、角化异常性皮肤病、光老化性皮肤病、银屑病、扁A酸被氧化破坏，提高维A酸的稳定性，减少细胞膜脂质和脂蛋白的过氧化，还具有较强的保湿作用，从而与维A酸起协同作用[5-6]。尿囊素可促进细胞生长，加快伤口愈合，软化角质蛋白，可用于缓解和治疗皮肤干燥症、鳞屑性皮肤病等，与维A酸和维生素E具有协同作用[7-8]。近年研制的复方维A酸乳膏（批准文号：辽药制字LBH00782005），主要成分为维A酸、维生素E和尿囊素[9-10]，为O/W型乳膏。为提高复方维A酸乳膏的疗效及稳定性，更好地控制其质量，笔者采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法建立了同时测定其中尿囊素、维A酸、异维A酸和维生素E含量的方法。

1 材料

Utimate 3000HPLC仪（美国戴安公司）；SB-5200D超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司），BS-110S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

复方维A酸乳膏（大连市皮肤病医院自制，O/W型，含维A酸、尿囊素、维生素E分别为0.1%、1%、2%，批号：121201、121201-1、121201-2、121201-3）；尿囊素、维A酸、异维A酸和维生素E对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111501-200202、100307-200902、100224-200903、100062-201110）；冰醋酸（分析纯，购于天津市科密欧化学试剂有限公司）；甲醇（色谱纯，美国Tedia公司）；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ODSSyncronis C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-水-0.5%冰醋酸，梯度洗脱程序及检测波长见表1；进样量：20μl；柱温：35℃。

表1 流动相梯度洗脱程序及检测波长Tab 1 Gradient elution process ofmobile phase and detection wavelength

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品贮备液的制备 精密称取尿囊素0.5 g、维生素E 1.0 g，分别置于10m l量瓶中，再精密称取维A酸0.1 g、异维A酸0.05 g，置于同一10m l量瓶中，分别加入甲醇加热溶解并稀释至刻度，摇匀，即得尿囊素对照品贮备液、维生素E对照品贮备液、维A酸和异维A酸对照品混合贮备液。

2.2.2 对照品溶液的制备 分别精密量取尿囊素对照品贮备液2m l、维生素E对照品贮备液2m l、维A酸和异维A酸对照品混合贮备液1m l，置于50m l量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得对照品溶液。

2.2.3供试品溶液的制备 精密称取样品5 g，加甲醇80m l，置于索氏提取器中水浴加热回流4 h，提取液转移至100m l量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得供试品溶液。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 称取不含维A酸、维生素E、尿囊素的样品5 g，按“2.2.3”项下方法制成阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验

分别取“2.2”项下对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，色谱见图1。结果显示，尿囊素、异维A酸、维A酸、维生素E保留时间分别是5.38、15.43、17.25、27.79min，分离度均＞1.5，理论板数均不低于3 000。

图1 高效液相色谱图A.对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.尿囊素；2.异维A酸；3.维A酸；4.维生素EFig 1 HPLC chromatogram sA.substance control；B.teat sample；C.negative control；1.allantoin；2.isomerization A acid；3.vitam in A acid；4.vitam in E

2.4 线性关系考察

分别精密量取“2.2.2”项下对照品液50、25、12.5、6.25、3.125m l，置于50m l量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得到系列浓度溶液。按“2.1”项下色谱条件分别吸取20μl进样，记录色谱。以各成分峰面积（y）为纵坐标，检测质量浓度（x，μg/m l）为横坐标，进行线性回归，回归方程和线性范围详见表2。

表2 回归方程和线性范围Tab 2 Regression equation and linear range

2.5 精密度试验

精密量取“2.2.2”项下对照品溶液20μl，分别按“2.1”项下色谱条件于1 d内重复进样测定5次和连续测定5 d。结果，尿囊素、维A酸、异维A酸、维生素E的日内RSD分别为0.42%、0.59%、0.80%、0.43%，日间RSD分别为0.55%、0.81%、0.40%、0.37%，表明本方法日内、日间精密度均良好。

2.6 稳定性试验

取样品（批号：121201）5 g，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，25℃下放置，分别于0、24、48、72、96 h时进样测定。结果，尿囊素、维A酸、异维A酸、维生素E的RSD分别为0.26%、 0.59%、0.63%、0.52%，表明96 h内供试品溶液稳定性良好。

2.7 重复性试验

取样品（批号：121201）5 g，共6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果，尿囊素、维A酸、异维A酸、维生素E的RSD分别为0.32%、0.59%、0.69%、0.88%，表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知各成分含量的样品（批号：121201）6份，每份5 g，分别置于100m l量瓶中，各精密加入“2.2.2”项下对照品溶液25m l，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定并计算加样回收率，结果见表3。

表3 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 3 Results of recovery tests（n＝6）

2.9 样品含量测定

取3批样品各适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，按外标法以峰面积计算各成分含量，结果见表4。

表4 样品含量测定结果（mg/g，n＝3）Tab 4 Content determ ination of sam p les（mg/g，n＝3）

3 讨论

笔者采用RP-HPLC法，不仅同时测定了复方维A酸乳膏中维A酸、尿囊素和维生素E三组分的含量，还测定了降解产物异维A酸的含量。由于维生素E和维A酸为脂溶性成分，尿囊素为水溶性成分，维A酸与异维A酸又互为异构体，因此笔者采用梯度洗脱方式在0～6m in，采用5%甲醇水溶液洗脱尿囊素；在＞6～18m in，采用甲醇-0.5%冰醋酸进行洗脱，减慢流速为1m l/min，使维A酸与异维A酸达基线分离，＞18～30 m in，采用100%纯甲醇洗脱维生素E。

为缩短保留时间，笔者曾在流动相中加入异丙醇和四氢呋喃，但发现保留时间无显著改变，且加入四氢呋喃后异维A酸与维A酸分离度反而降低，故均未采用。笔者又尝试提高柱温，通过对25、30、35、40℃不同柱温的研究发现，随着柱温的升高，样品的保留时间逐渐缩短，当柱温达到40℃时维A酸与异维A酸分离度降低，因此选用35℃柱温。

在本试验中，笔者分别对150mm和250mm的色谱柱进行了比较。结果表明，150mm色谱柱保留时间较250mm略有缩短，但是异维A酸与维A酸的分离度在选用250mm色谱柱时显著优于150mm（150mm异维A酸与维A酸的分离度小于1.5），故选用250mm的C18色谱柱，进样时间30min。

综上所述，本法操作简便、快速、准确，适用于同时测定复方维A酸乳膏中尿囊素、维A酸、异维A酸和维生素E的含量。

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Simultaneous Determ ination of Allantoin，Tretinion，Isomerization A Acid and Vitam in E in Com pound Tretinion Cream by RP-HPLC

ZHANG Zhi-qin1，LIMei2，ZHU Chang-hui1，WANG Dong1，HAN Guo-zhu2，TANG Ze-yao2（1.Dalian Dermatology Hospital，Liaoning Dalian 116021，China；2.Dept.of Pharmacology，Dalian Medical University，Liaoning Dalian 116044，China）

OBJECTIVE：To develop a method for simultaneous determ ination of allatoin，tretinion，isomerization A acid and vitam in E in Compound tretinion cream.METHODS：RP-HPLC method was adopted.The determ ination was performed on ODS Syncronis C18column w ith mobile phase consisted of methanol-water-0.5%glacial acetic acid（gradient elution at different flow rates and detection wavelength）；sample size was 20μl and column temperature was 35℃.RESULTS：The linear ranges were 125-2 000μg/m l for allantoin（r＝0.999 8），12.5-200μg/m l for tretinoin（r＝0.999 9），6.25-100μg/m l for isomerization A acid（r＝0.999 8）and 250-4 000μg/m l for vitam in E（r＝0.999 9）.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 0.88%.Average recoveries were 99.5%（RSD＝0.24%，n＝6），97.6%（RSD＝0.97%，n＝6），99.8%（RSD＝0.18%，n＝6）and 99.0%（RSD＝0.72%，n＝6）.CONCLUSIONS：Themethod is simple，rapid，accurate and suitable for the content determ ination of allatoin，tretinion，isomerization A acid and vitam in E in Compound tretinion cream.

Compound tretinion cream；A llantoin；Tretinion；Isomerization A acid；Vitam in E；RP-HPLC平疣及皮肤肿瘤等[2-3]。但是，现有市售的维A酸乳膏均为单方制剂，稳定性较差，维A酸极易见光异构化降解产生异维A酸，疗效并不理想[4]。维生素E为强抗氧化剂，能阻止乳膏中维

R917

A

1001-0408（2014）12-1131-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2014.12.26

＊药师，硕士。研究方向：药物制剂与质量控制。电话：0411-83781004。E-mail：zhangzhiqin_520666@163.com

2013-10-24

2013-11-26）