HPLC一测多评法用于木香及3种含木香中药复方制剂的质量评价Δ

杨 宪，刘筱琴，张 雪，杨水平，余晓东，和七一，赵 瑛（.重庆师范大学生命科学学院，重庆033；.重庆化工职业学院应用化学系，重庆 0000；3.重庆市中药研究院，重庆 00065；.西南大学资源环境学院，重庆 0076）

HPLC一测多评法用于木香及3种含木香中药复方制剂的质量评价Δ

杨 宪1＊，刘筱琴2，张 雪3#，杨水平4，余晓东1，和七一1，赵 瑛1（1.重庆师范大学生命科学学院，重庆401331；2.重庆化工职业学院应用化学系，重庆 400020；3.重庆市中药研究院，重庆 400065；4.西南大学资源环境学院，重庆 400716）

目的：建立测定木香及3种含木香的中药复方制剂中木香烃内酯和去氢木香内酯含量的方法。方法：采用高效液相色谱（HPLC）一测多评法，选取木香烃内酯作为内参物，建立该成分与去氢木香内酯的相对校正因子（f），从而对木香及3种含木香的中药复方制剂中的木香烃内酯和去氢木香内酯进行含量测定。结果：木香烃内酯和去氢木香内酯的进样量分别在0.101 2～3.036 0μg（r＝0.999 8）和0.101 8～3.084 0µg（r＝0.999 9）范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系；f＝1.077 7，用木香烃内酯加f测得去氢木香内酯的加样回收率为99.53%，RSD＝1.11%（n＝9）。结论：该试验首次采用HPLC一测多评法测定了木香和3种含木香的中药复方制剂中木香烃内酯和去氢木香内酯的含量，方法准确、可行。

一测多评法；校正因子；木香烃内酯；去氢木香内酯；木香；中药复方制剂；含量测定

＊高级工程师，博士。研究方向：中药新药及保健食品开发。E-mail：yyxdsp@163.com

#通信作者：副研究员，硕士。研究方向：药用植物栽培技术。E-mail：zhangxue0012003@163.com

木香及3种含木香的中药复方，包括六味木香散（由木香、栀子、闹羊花等6味中药组成）、麻仁润肠丸[由火麻仁、苦杏仁（去皮炒）、大黄、木香等6味中药组成）、五味麝香丸[由麝香、诃子（去核）、黑草乌、木香、藏菖蒲5味药材组成]，在2010年版《中国药典》（一部）中均有收载。上述3种复方均具有行气导滞、泻热通便之功效，适用于湿热内停、赤白痢疾、大便不通等证，广泛用于治疗各种肠胃疾病[1-4]，因而全国有数百家制药厂均在生产，是市场流通量较大的中成药之一。但是，目前对这些复方的质量控制较弱，导致了在产品质量方面的一些问题。鉴于此，本研究首次运用“一测多评”的思路，以木香烃内酯加校正因子，采用高效液相色谱（HPLC）法对木香及3种含木香的中药复方同时测定其中木香烃内酯和去氢木香内酯的含量，并对该方法在中药质量控制中的可靠性进行了验证。

1 “一测多评”的原理

“一测多评”的原理如下：在线性范围内某成分的质量或者浓度与检测器响应成正比，即：W＝fA，在多指标质量评价时，以某药材中有对照品供应的一典型成分为内参物，建立该成分与其他成分之间的相对校正因子（f），进而通过f计算其他成分的含量。这种通过测定其中一个成分，实现对多个成分定量的方法称为“一测多评”[3-5]。

假设某样品中含有i个成分，则：

式中，Wi为成分浓度；Ai为成分峰面积。选取其中之一的成分k为内参物，建立成分k与其他成分m之间的f，则：

式（2）中，Ak为内参物峰面积；Wk为内参物浓度；Am为其他成分m的峰面积；Wm为其他成分m的浓度。

2材料

2.1 仪器

LC-2010A型HPLC仪（日本岛津公司）、2690-2487型HPLC仪（美国Waters公司）、1200型HPLC仪（美国Agilent公司），均包括脱气机、自动进样器、柱温箱；AE163型十万分之一电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-1000型超声波处理器（昆山市超声仪器有限公司）。

2.2 药品与试剂

六味木香散、麻仁润肠丸、五味麝香丸（购自重庆桐君阁大药房，批号分别为20120801、130201、130102）；木香烃内酯、去氢木香内酯对照品（国家标准物质标准样品信息中心，批号分别为553-21-9、477-43-0，化学结构式见图1）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为双蒸水。

图1 木香烃内酯和去氢木香内酯的化学结构式A.木香烃内酯；B.去氢木香内酯Fig 1 Chem ical structures of costunolide and dehydrocostus lactoneA.costunolide；B.dehydrocostus lactone

2.3 药材

木香药材分别于不同时间采自重庆开县、云南丽江、陕西西安、湖北利川、湖南益阳、广东广州、广西南宁、四川雅安，均经重庆中药研究院张雪副研究员鉴定为真品。

3 方法与结果

3.1 色谱条件与系统适用性试验

参照2010年版《中国药典》（一部）木香项下色谱条件[2]：流动相为甲醇-水（65∶35，V/V），流速为1.0 m l/min，柱温为30Ⅱ，进样量为10µl，检测波长为225 nm。结果显示，木香烃内酯和去氢木香内酯色谱峰的峰形尖锐、对称性好；供试品中木香烃内酯和去氢木香内酯的色谱峰对称性好，与前后其他峰的分离度均＞1.5，达到了基线分离。色谱见图2。

3.2 溶液的制备

3.2.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取干燥至恒质量的木香烃内酯和去氢木香内酯对照品适量，加甲醇制成每1m l含木香烃内酯0.506mg、去氢木香内酯0.514mg的溶液，作为两种单一成分的对照品贮备液。精密吸取两种对照品贮备液各2m l，置于同一10m l量瓶中，加甲醇定容，即得混合对照品溶液。

图2 高效液相色谱图A.混合对照品；B.木香药材；1.木香烃内酯；2.去氢木香内酯Fig 2 HPLC chromatogram sA.m ixed control；B.Aucklandia lappa samples；1.Costunolide；2.Dehydrocostus lactone；

3.2.2 木香药材溶液的制备 取木香粉末（过四号筛）约0.30 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50m l，密塞，摇匀，称定质量，放置过夜，超声处理（功率：250W，频率：50 kHz）30min，取出，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.2.3 各中药复方溶液的制备 （1）六味木香散供试品溶液：取本品粉末约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50m l，称定质量并放置过夜，超声处理（功率：250W，频率：50 kHz）30m in后取出，放冷后再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。（2）麻仁润肠丸供试品溶液：取本品研细的细粉约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50m l，密塞，称定质量并放置过夜，超声处理（功率：250W，频率：50 kHz）30m in后取出，放冷后再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。（3）五味麝香丸供试品溶液：取粉碎后的本品1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入氯仿25m l，密塞，称定质量并放置过夜，超声处理（功率：250W，频率：50 kHz）30min后取出，放冷后再称定质量，用氯仿补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5m l，置蒸发皿中挥干，残渣加甲醇使溶解，转移至5m l量瓶中，即得。

3.3 f的测定方法

取木香烃内酯和去氢木香内酯对照品溶液各适量，按“3.1”项下色谱条件用自动进样器分别进样30、20、10、5、2、1 µl，按公式（1），以木香烃内酯为内参物，计算去氢木香内酯的f值。

3.4 f测定方法的耐用性研究

3.4.1 仪器的检测波长λ对f的影响 HPLC仪紫外检测器的λ存在偏差，且λ示值误差为±2 nm，因此笔者分别在229、227、225、223、221 nm波长处测定并计算去氢木香内酯的f，考察λ的变化对f的影响，详见表1。

表1 仪器λ的变化对f的影响Tab 1 Effectsof the changesof detection wavelength on correction factor（f）

表1结果表明，在同一台HPLC仪上，λ在已确定波长处变化为±2 nm或±4 nm，对木香烃内酯计算所得去氢木香内酯的f影响不大，RSD＝0.79%（n＝5）。

3.4.2 仪器流速对f的影响 HPLC仪的流速也可能有偏差，在使用同一台HPLC仪时，检定误差应为±2%，因此笔者分别在流速为0.98、1.00、1.02m l/min时测定并计算去氢木香内酯的f，考察流速变化0.02m l/m in对f的影响。进一步扩大试验，计算0.80、1.20m l/min流速下去氢木香内酯的f，考察流速变化对f的影响，详见表2。

表2 仪器流速变化对f的影响Tab 2 Effects of the changes of flow rate on correction factor（f）

表2结果表明，在同一台HPLC仪上，流速变化对木香烃内酯计算所得去氢木香内酯的f影响不大，RSD＝1.05%（n＝5）。

3.4.3 HPLC柱温对f的影响 HPLC仪的柱温箱也是有偏差的。《药品检验仪器检定规程》中规定环境温度在10～30Ⅱ内，8 h内的温度波动为±3Ⅱ，HPLC仪柱温箱的误差是±0.1Ⅱ，因此笔者采用同一台HPLC仪，分别在33.0、30.1、30.0、29.9、27.0Ⅱ测定并计算去氢木香内酯的f，考察HPLC柱温变化对f的影响，详见表3。

表3 HPLC柱温变化对f的影响Tab 3 Effects of the changes of colum n tem perature on correction factor（f）

表3结果表明，在同一台HPLC仪上，柱温变化对木香烃内酯计算所得去氢木香内酯的f影响不大，RSD＝0.39%（n＝5）。

3.4.4 流动相比例对f的影响 HPLC仪的流动相比例也会对对照品的f造成影响，因此笔者使用同一台HPLC仪，选择流动相甲醇-水的比例分别为55∶45、60∶40、65∶35、70∶30、75∶25（V/V）时测定并计算去氢木香内酯的f，考察流动相比例对f的影响，详见表4。

表4 流动相比例对f的影响Tab 4 Effects of the composition proportion of mobile phaseon correction factor（f）

表4结果表明，在同一台HPLC仪上，流动相比例变化对木香烃内酯计算所得去氢木香内酯的f影响不大，RSD＝1.04%（n＝5）。

3.4.5 同规格不同品牌HPLC柱对f的影响 HPLC仪在定量测定时会使用不同品牌的液相色谱柱，笔者采用同一台HPLC仪，使用5支同规格不同品牌的液相色谱柱（C18，250mm×4.6 mm，5µm）测定并计算去氢木香内酯的f，考察同规格不同品牌的HPLC柱对f的影响，详见表5。

表5 同规格不同品牌的HPLC柱对f的影响Tab 5 Effects of chromatographic columnsw ith same specification from differentbrandson correction factor（f）

表5结果表明，在同一台HPLC仪上更换液相色谱柱，对木香烃内酯计算所得去氢木香内酯的f影响不大，RSD＝0.83%（n＝5）。

3.4.6 不同HPLC仪对f的影响 笔者采用岛津ODS液相色谱柱（250mm×4.6mm，5µm），分别在3台HPLC仪上测定并计算去氢木香内酯的f，考察不同HPLC仪对f的影响，详见表6。

表6 不同HPLC仪对f的影响Tab 6 Effects of different HPLC instrument on correction factor（f）

表6结果表明，HPLC仪的变化对木香烃内酯计算所得去氢木香内酯的f影响不大，SD＝0.94%（n＝3）。

根据“3.4.1”至“3.4.6”项下所得值计算平均值：f＝（1.079 0+ 1.074 3+1.079 3+1.077 0+1.075 3+1.081 3）/6＝1.077 7。

3.5 方法学考察

3.5.1 线性关系考察 按“3.2.1”项下方法制备对照品去氢木香内酯和替代对照品木香烃内酯溶液，在“3.1”项下色谱条件下，按“3.4”项下f测定方法进行测定。结果表明，木香烃内酯、去氢木香内酯进样量分别在0.101 2～3.036 0、0.101 8～3.084 0 μg范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系。二者的回归方程分别为y＝1×106x+4 496.4（r＝0.999 8，n＝6）、y＝1× 106x－8 791.8（r＝0.999 9，n＝6）。

3.5.2 精密度试验 取“3.2.1”项下混合对照品溶液适量，在“3.1”项下色谱条件下重复进样6次，测定峰面积。结果显示，木香烃内酯和去氢木香内酯的RSD分别为0.76%和1.25%（n均为6），表明仪器精密度良好。

3.5.3 重复性试验 取同一批木香药材粉末适量，按“3.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“3.1”项下色谱条件下进样测定。结果显示，木香烃内酯和去氢木香内酯的RSD分别为0.84%和1.13%（n均为6）。取同一批六味木香散样品适量，按“3.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“3.1”项下色谱条件下进样测定。结果显示，木香烃内酯和去氢木香内酯的RSD分别为0.97%和1.21%（n均为6）。表明本方法重复性良好。

3.5.4 稳定性试验 取同一批木香药材供试品溶液适量，分别于0、2、4、8、12、16 h在“3.1”项下色谱条件下进样测定。结果显示，木香烃内酯和去氢木香内酯的RSD分别为0.93%和 0.81%（n均为6），表明木香药材供试品溶液在16 h内稳定性良好。取同一批六味木香散的供试品溶液适量，分别于0、2、4、8、12、16 h在“3.1”项下色谱条件下进样测定。结果显示，木香烃内酯和去氢木香内酯的RSD分别为0.76%和1.04%（n均为6），表明六味木香散的供试品溶液在16 h内稳定性良好。

3.5.5 加样回收率试验 取已知含量的同一批木香药材样品（重庆开县产，木香烃内酯含量：18.36mg/g，去氢木香内酯含量：25.81mg/g）9份，各约0.15 g，精密称定，分别置于50m l锥形瓶中，每3份为一组，分别按80%、100%和120%的加入量精密加入木香烃内酯和去氢木香内酯对照品溶液，照“3.2.2”项下方法制备供试品溶液。按拟定方法，各精密吸取10μl注入HPLC仪，在“3.1”项下色谱条件下测定，计算加样回收率，结果分别见表7、表8。再采用木香烃内酯加f的方法对去氢木香内酯进行含量测定，计算加样回收率，结果见表9。

表7 木香烃内酯的加样回收率（n＝9）Tab 7 Recovery ratesof costunolide（n＝9）

表8 用去氢木香内酯对照品按外标法直接测定的回收率（n＝9）Tab 8 Recovery rates of dehydrocostus lactone according to internalstandard（n＝9）

表9 用木香烃内酯加f测得去氢木香内酯的回收率（n＝9）Tab 9 Recovery rates of dehydrocostus lactone according to costunolideand f（n＝9）

3.6 样品含量测定

3.6.1 木香药材的含量测定 取8批木香药材各适量，分别按“3.2.2”项下方法制备供试品溶液，再取木香烃内酯、去氢木香内酯对照品溶液适量，在“3.1”项下色谱条件下进样测定，计算各批木香药材中木香烃内酯和去氢木香内酯的含量。另外，根据f由木香烃内酯含量推算出各批木香药材中去氢木香内酯的含量，结果见表10。

表10 木香药材中各成分的含量（mg/g，n＝3）Tab 10 Contentsof each com ponent in A.lappa（m g/g，n＝3）

3.6.2 各中药复方的含量测定 取各中药复方适量，分别按“3.2.3”项下方法制备供试品溶液，再取木香烃内酯、去氢木香内酯对照品溶液适量，在“3.1”项下色谱条件下进样测定，计算3种中药复方中木香烃内酯和去氢木香内酯的含量。另外，根据f由木香烃内酯含量推算出3种中药复方中去氢木香内酯的含量，结果见表11。

表11 中药复方制剂中各成分的含量（mg/g，n＝3）Tab 11 Contents of each com ponent in TCM com pound preparations（mg/g，n＝3）

表10、表11结果表明，对木香药材及3种含木香的中药复方，通过常规外标法实测含量与“一测多评”法计算所得含量没有明显差异。

4 讨论

本研究选用木香烃内酯为内参物，建立该成分与去氢木香内酯的f，并对HPLC仪的λ、流速、柱温、流动相比例和同规格不同品牌的液相色谱柱，以及不同的HPLC仪进行考察，结果表明本方法简单、可行，可应用于木香及含木香的中药复方的多指标成分含量测定。用“一测多评”法所得木香药材及含木香的中药复方中各成分含量与常规外标法所测含量没有明显差异，说明在去氢木香内酯对照品缺乏的情况下，可通过“一测多评”法实现多成分的同步含量测定[6-9]。

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Quality Evaluation ofAucklandia lappaand 3 TCM Com pound Preparations ContainingA.lappaby HPLC M ulti-com ponentsQuantitation by OneM arker

YANG Xian1，LIU Xiao-qin2，ZHANG Xue3，YANG Shui-ping4，YU Xiao-dong1，HE Qi-yi1，ZHAO Ying1（1.College of Life Science，Chongqing Normal University，Chongqing 401331，China；2.Dept.of Applied Chemistry，Chongqing Chem ical Industry Vocational College，Chongqing 400020，China；3.Chongqing Academy of TCM，Chongqing 400065，China；4.College of Resources and Environment，Southwest University，Chongqing 400716，China）

OBJECTIVE：To established a method for the content determ ination of costunolide and dehydrocostus lactone inAucklandia lappaand 3 TCM compound preparations containingA.lappa.METHODS：The contents of costunolide and dehydrocostus lactone inA.lappaand 3 TCM compound preparations containingA.lappawere determined by HPLC multi-components quantitation by one marker，using costunolide as internal standard and the correction factor（f）of costunolide to dehydrocostus lactone. RESULTS：The linear ranges of costunolide and dehydrocostus lactone were 0.101 2-3.036 0μg（r＝0.999 8）and 0.205 6-6.168 0 µg（r＝0.999 9）；thefof costunolide was 1.077 7，and average recovery of dehydrocostus lactone was 99.53%（RSD＝1.11%，n＝9），respectively.CONCLUSIONS：The quantitativemethod using onemarker for simultaneous assay is feasible and applied for quality control ofA.lappaand 3 TCM compound preparations containingA.lappa.

Multi-components quantitation by one marker；Correction factor；Costunolide；Dehydrocostus lactone；Aucklandia.lappa；TCM compound preparation；Content determ ination

R284.1；R283；R917

A

1001-0408（2014）11-1030-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2014.11.25

重庆市教委科学技术研究项目（No.KJ130618）；重庆师范大学校级基金项目（No.12XLB028）

2013-10-31

2014-01-04）