灰葡萄孢对杀菌剂抗性研究进展

韩之琪 贲海燕 谢学文 石延霞李宝聚

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

灰葡萄孢对杀菌剂抗性研究进展

韩之琪 贲海燕 谢学文 石延霞*李宝聚*

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

灰葡萄孢寄主范围广泛，可引起多种蔬菜、果树及观赏作物发生灰霉病。近年来，灰葡萄孢对杀菌剂产生越来越严重的抗药性，本文综述了国内外多种寄主植物上的灰葡萄孢对不同杀菌剂产生的抗药性、抗性机制、抗性菌株检测方法等方面的研究进展，并对未来研究方向进行了展望。

灰葡萄孢；抗药性；检测方法；综述

灰霉病由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）感染寄主引起，其有性世代为富克尔核盘菌（Botrytinia fuckeliana），可以为害番茄、黄瓜、西葫芦、草霉、葡萄、菜豆以及一些花卉作物，造成严重的经济损失。一直以来，防治灰霉病主要依靠化学药剂，但由于灰葡萄孢的产孢量大，寄主范围广，存在准性生殖和异核现象，遗传变异量大（Hansen & Smith，1932），导致其在过去的几十年中由于大量施用化学药剂而产生严重的抗药性。

1 灰葡萄孢的抗药类型及抗性机制

1.1苯并咪唑类杀菌剂（Benzimidazol，Ben）

Ben类杀菌剂包括苯菌灵、多菌灵、甲基托布津等。研究表明，该类药剂主要是通过与病原菌的β-微管蛋白结合从而影响微管发挥功能，进而对菌株产生药效。而抗性菌株表现出β-微管蛋白与杀菌剂的亲和力下降（Davides，1986）。分子学研究认为，菌株对Ben类杀菌剂的抗性与病原菌β-微管蛋白基因上个别碱基发生突变有关，突变位点主要集中在氨基酸第198位和第200位，高抗菌株的β-微管蛋白基因第198位密码子由GAG（Glu）突变成GCG（Ala）或AAG（Lys）；中抗菌株的第200位密码子由TTC（Phe）突变成TAC（Tyr）（Banno et al.，2008）。当抗性种群产生并上升到一定比例后，该类杀菌剂的防效会显著降低，甚至失效；而且对该类杀菌剂的抗性不会因为Ben类杀菌剂停用而下降。

1.2二甲酰亚胺类（Dicarboximides，DCFs）

DCFs类杀菌剂包括腐霉利、异菌脲、乙烯菌核利等。20世纪70年代后，由于灰葡萄孢对Ben类杀菌剂产生了广泛的抗药性，新开发出的DCFs类杀菌剂开始应用于灰霉病的防治。在其广泛应用的同时，灰葡萄孢对该类药剂的抗性也开始有所表现。

关于DCFs类杀菌剂对灰葡萄孢的杀菌机制已有研究报道。在形态学上，病原菌表现出明显的分枝增加、局部肿胀等，药剂浓度高时可导致其胀裂（Sisler，1988）。然而此类药剂杀菌的分子生物学机制的研究还处于初始阶段。最近有关研究表明，DCFs类杀菌剂可能通过干扰渗透压传导途径发挥抑菌作用（Oshima et al.，2006）。Lerous等（2002）研究发现，灰葡萄孢对DCFs类杀菌剂的抗性可能与编码组氨酸激酶基因的突变有关，对灰葡萄孢野生抗性菌株的双组分组氨酸激酶基因BcOs1进行克隆测序，该基因编码的蛋白N端以92个氨基酸为单位的6个串连重复区是DCFs类杀菌剂的结合位点，其中第2个重复区的氨基酸突变与抗药性的产生有关。Oshima等（2002）研究发现位于第2个重复区的第365位的异亮氨酸突变为丝氨酸，这一突变与抗性产生相关。此后，Banno等（2008）利用杂交探针技术检测出该区域的位点突变可能有I365S、V368F、Q369H和Q369P。因此决定灰葡萄孢的抗性突变位点尚无定论，有待更进一步的研究证实。

1.3 N-苯基氨基甲酸酯类（N-phenylanilines，NPC）

NPC类杀菌剂的代表药剂为乙霉威，其作用机理与Ben类杀菌剂相同，都是作用于病原菌的β-微管蛋白，阻碍有丝分裂（Yarden & Katan，1993）。在灰霉病的防治中，Ben类杀菌剂是应用最早的一类杀菌剂，也是目前产生抗性最严重的一类。由于NPC类与Ben类呈负交互抗性，因此将二者制成混剂使用，防治蔬菜灰霉病效果显著，可以解决灰葡萄孢对Ben类杀菌剂的抗性问题。

但随着这类杀菌剂的广泛使用，对NPC类和Ben类杀菌剂的双抗菌株在田间出现，并快速扩增。而且已经出现对Ben类、DCFs类和NPC类杀菌剂的多抗菌株，北京地区已检测到了对这3类杀菌剂都产生抗性的抗药类型：BenRDicSNPCS、BenSDicSNPCR、BenRDicRNPCS和BenRDicRNPCR（乔广行 等，2011）。

1.4苯胺基嘧啶类（Anilinopyrimidines）

苯胺基嘧啶类杀菌剂是在灰葡萄孢对NPC类杀菌剂产生抗性后研制而成的，目前主要有5种：嘧菌胺（mepanipyrim）、嘧菌环胺（cyprodinil）、嘧霉胺（pyrimethanil）、氟嘧菌胺（diflumetorim）和andoprim（刘长令 等，2000）。关于此类杀菌剂的作用机制目前有2种假说，一是通过抑制胱硫醚β-裂解酶来抑制菌体内甲硫氨酸的生物合成，从而抑制菌丝的生长；另一种可能是通过抑制病菌胞外蛋白酶（包括水解酶）的分泌阻碍病菌发挥致病性（Miura et al.，1994；Milling & Richardson，1995）。然而灰葡萄孢对嘧霉胺的抗药性也已经产生，瑞士（Hilber & Schüepp，1996）、法国（Chapeland et al.，1999）、智利（Latorre et al.，2002）等地相继报道灰葡萄孢对这类药剂产生了抗性。虽然嘧霉胺在我国的使用年份不长，但已有报道称在辽宁、江苏、浙江等地发现了抗嘧霉胺菌株（纪明山 等，2003）。

1.5对苯二酚氧化抑制剂类（Quinol oxidation inhibitors，QoIs）

QoIs类杀菌剂的代表药剂为醚菌酯和嘧菌酯。该类杀菌剂的作用机制是通过束缚致病菌的细胞色素bc1复合体外的对苯二酚氧化位点，达到阻滞电子传递的效果，导致ATP合成量大幅降低，从而达到杀菌的效果（Fernández-Ortuño et al.，2008）。但是目前也已经发现有多种病原菌对QoIs类杀菌剂产生了抗药性，其中包括灰葡萄孢（Wedge et al.，2007）。

研究表明，病原菌对QoIs类杀菌剂产生抗性的分子机制与靶标位点选择和编码线粒体中细胞色素b的基因突变有关（Sierotzki et al.，2007）。在已经产生抗药性的致病菌中发现3种类型的氨基酸替换，分别是第143位密码子由甘氨酸突变成丙氨酸，第137位密码子由甘氨酸突变成丙氨酸，第129位密码子由苯丙氨酸突变成亮氨酸，其中发生第143位密码子突变的菌株抗药性最强（Gisi et al.，2002；Kim et al.，2003）。

1.6其他新型杀菌剂

除以上几类常用药剂之外，一些新型药剂也被用来防治灰霉病，如DMI类杀菌剂（戊唑醇）、酰胺类杀菌剂（环酰菌胺）以及苯基吡咯类（咯菌腈）等。近期在一些国家报道了有关此类新型药剂的抗性菌株，如德国发现了对环酰菌胺和咯菌腈的抗性菌株（Weber & Hahn，2011）；2007～2009年、2011年，在智利葡萄园中发现了对戊唑醇、环酰菌胺和咯菌腈的单抗及多抗菌株（Latorre & Torres，2012）。但目前还没有关于此类杀菌剂抗性机制研究的报道。

2 抗药性的生物化学检测方法

随着灰葡萄孢抗药性的逐年增高，在推广某一类型的杀菌剂后开展抗药性监控（包括抗性频率、抗性水平和抗性亚群体的分布）是病害综合防治中不可缺少的内容。目前，国内外对灰葡萄孢抗药性的检测方法仍以生物化学方法为主，包括传统的杀菌剂室内生测方法：孢子萌发法、菌丝生长速率法以及微孔板法。前两者都是以含药培养基为介质，观察菌丝或者孢子的生长状况，并以此作为判定是否产生抗药性的依据；微孔板法是一种新的检测方法，是利用酶标仪的比色功能快速检测微孔板（96孔板）中悬浮液的吸光度值（OD值），以OD增加值作为评价指标。与前两种传统方法相比，微孔板法综合了孢子萌发法和菌丝生长速率法的优势，测试速度快、结果准确、重现性好，具有良好的实用性（杨晓楠 等，2012）。

3 抗药性的分子生物学测定技术

目前，对于已明确抗性突变位点的菌株，以PCR反应为基础的分子检测技术方便快捷，并且发展迅速。本文主要介绍以下3种：PCR-RFLP技术、ARMS-PCR技术和杂交探针测定技术。

3.1限制性片段长度多态性聚合酶链式反应（PCR-RFLP）技术

该技术的基本原理是利用设计的特异性引物对目标核酸片段进行PCR扩增，PCR产物用特异性内切酶消化切成大小不同的片段，检测其多态性，从而检测目标片段中的突变或缺失。例如对于二甲酰亚胺类的抗性菌株，组氨酸激酶BcOS1基因中的第365位突变可以通过该方法检测（Oshima et al.，2006）。

3.2等位基因特异PCR（ARMS-PCR）技术

该技术的关键是根据已知的突变设计适当的引物，PCR反应中含突变位点的模板因3′末端错配导致产物减少，以此来检测基因突变。该方法准确、简单，与生物化学法的测定结果一致，是一种以传统PCR技术为基础的单核苷酸变异鉴定手段，不需要PCR-RFLP以及嵌套式PCR反应，只需一步简单的PCR就可完成。可以通过该技术确定灰葡萄孢的β-微管蛋白上的单基因突变，有效地鉴定对Ben类杀菌剂具有抗性的菌株（Muñoz et al.，2009）。

ARMS-PCR技术与PCR-RFLP技术相结合可用来快速鉴定对QoIs类杀菌剂产生抗药性的灰葡萄孢菌株（Banno et al.，2009）。具体方法：提取抗性菌株的基因组DNA，设计PCR引物cytb-BcF和cytb-BcR，PCR扩增细胞色素b（cytb）的基因序列，接着利用等位基因特异性PCR技术检测cytb基因中发生的G-C突变，引物对为BcAR-F和BcAR-R（Jiang et al.，2009），该引物可以扩增出抗性菌株中线粒体基因组的特异片段，大小为260 bp左右，扩增产物在PCR-RFLP体系中经限制性内切酶Ita I的剪切作用产生多态性片段，通过凝胶电泳分辨，达到鉴定抗性菌株的目的（Sierotzki et al.，2000；Furuya et al.，2009）。

刘德荣 等（2001）利用该技术建立了一种专门用来检测灰葡萄孢对Ben类和NPC类双抗菌株的方法，作用原理是根据灰葡萄孢对这两种杀菌剂的抗性与其β-微管蛋白的第198位和第200位密码子的单碱基突变有紧密的关系（Yarden & Katan，1993）。具体方法：将突变的单碱基作为正向引物的3′末端，未突变的单碱基作为反向引物的3′末端，自行设计LP4～LP8等5个等位点特异性引物，应用包括这5条引物在内的7组引物对抗性表型为BenSNPCR、BenHRNPCS和BenHRNPCR的菌株进行ASP扩增（刘德荣 等，2001）。

该方法灵敏度高，能够检测出相应抗性表型的菌株并能有效地检测出田间灰霉病的抗药性，克服了生物检测方法的费时和准确性差等缺点，可应用于灰葡萄孢抗药性分子生态学机理研究和田间抗性菌株的快速鉴定。

3.3杂交探针测定技术

这是一种在实时定量PCR反应基础上的杂交探针荧光共振能量转移技术。两个临近的寡聚核苷酸探针上的荧光标签通过荧光共振能量转移互相识别，从而检测出模板DNA序列中的碱基变化，通过实时定量PCR的溶解曲线体现。该方法可以用来检测对Ben类和DCFs类药剂的抗性突变位点。检测出的抗Ben杀菌剂类的突变位点有β-微管蛋白BenA基因上的E198A、F200Y和E198K；抗DCFs杀菌剂类的突变位点有组氨酸激酶BcOS1基因上的I365S、V368F、Q369H和Q369P。与PCRRFLP技术和ARMS-PCR技术相比，荧光探针杂交技术操作更简单，更方便快捷。例如DNA模板的扩增和突变的检测可以在单管中进行，PCR反应之后不需要进行酶切和电泳。此外，该方法可以检测出一些还未确定突变的存在，而且可以以溶解曲线分析为依据确定混合DNA模板中的突变个体，并且可以在峰值温度相差大于5 ℃时，大概估算出此类个体在群体中所占比例。例如，二甲基亚胺敏感菌株（野生型）与抗二甲基亚胺菌株（I365S）的混合DNA的溶解曲线呈现出两个峰值，峰值温度差与种群原产地的地理位置有关，即温差越大相距越远（Banno et al.，2008）。

4 展望

灰霉病是一类危害严重的传统真菌病害，随着化学防治的普及，尽管不断有新型药剂开发应用于该病的防治，但灰葡萄孢对不同杀菌剂的抗药性还是在全球范围内迅速发展。从灰葡萄孢的抗药性的相关研究文献来看，总体研究虽有进展，但不成熟。由于一些杀菌剂对灰霉病的防治机理以及抗性产生的分子机制的研究还不透彻，无法为检测方法的建立提供充分理论依据，从而不能实现对抗药性准确、快速的检测。所以通过明确不同类型杀菌剂对灰葡萄孢的作用机理以及病菌对其产生抗药性的分子机制，建立有效的田间抗药性的分子检测方法是未来关于灰霉病防治的必然发展趋势。

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Research Progress on Botrytis cinerea Resistance to Different Fungicides

HAN Zhi-qi，BEN Hai-yan，XIE Xue-wen，SHI Yan-xia*，LI Bao-ju*

（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

Botrytis cinerea is a phytopathogenic fungi responsible for grey mould，which is an important disease in many species of fruit trees，vegetables and ornamental crops. Recently，B. cinerea has developed increasing severe resistance to a broad range of fungicides. This paper summarizes the research progress about B. cinerea at various host plant’s resistance to drugs，their resistance mechanism and methods for detecting tolerant bacteria reported at home and abroad. It also predicts the future orientation of this study.

Botrytis cinerea；Resistance to fungicides；Detection method；Review

韩之琪，女，硕士研究生，专业方向：植物病害防治，E-mail：zhiqihan@126.com

*通讯作者（Corresponding authors）：李宝聚，研究员，博士生导师，专业方向：蔬菜病害诊断与防治，E-mail：libaoju@caas.cn；石延霞，副研究员，硕士生导师，专业方向：植物病理、蔬菜病害诊断与防治，E-mail：shiyanxia813@163.com

2013-11-11；接收日期：2014-01-09

公益性行业（农业）科研专项（201303025），现代农业产业技术体系北京市叶类蔬菜创新团队建设专项（blvt-12）