荧光共振能量转移技术在激光共聚焦显微镜中的应用

肖忠新 张进禄*

目前，有许多蛋白与蛋白相互作用的研究方法，如亲和层析、免疫共沉淀、凝胶阻滞法、荧光光谱法及酵母双杂交等，而荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)方法可在多种细胞类型中定量研究蛋白-蛋白相互作用，具有其他方法不可比拟的优点，在近年来广受推崇[1]。20世纪30年代，法国物理学家Jean Perrin对FRET现象进行了描述，后由德国科学家Theodor[2]和Förster[3]阐明，从1992年绿色荧光蛋白克隆成功后，FRET逐渐成为研究活细胞中分子之间相互作用的强有力的技术方法[4]。

1 FRET基本原理

FRET是指两个荧光基团间能量通过偶极-偶极耦合作用以非辐射方式从供体传递给受体的现象，应用能量转移来测量分子内和分子间的距离。FRET技术可在单个固定细胞或活细胞原位生理环境下检测分子间的直接相互作用，如检测配体-受体、蛋白质-蛋白质、蛋白质折叠以及蛋白质二聚化等。21世纪初，FRET现象已可利用3种方式进行研究，即光学强度成像测量、光谱测量和寿命测量[5]。

FRET的效率(E)与供体-受体间距离(r)的6次方成反比，即其中R0是E=50%时的供体-受体距离，称为Förster距离或临界转移距离。FRET的发生需满足4个条件：供体-受体间距离≤10 nm；供体的发射光谱与受体的激发光谱有一定重叠；供体-受体偶极矩具有合适的相对取向；供体量子产率和受体光吸收系数足够高[6]。

2 FRET的测定方法

用激光共聚焦显微镜检测FRET具有独特的优势，利用其激光光源激发供体、多通道同时检测双重(或多重)荧光信号，并利用时间扫描程序检测荧光信号在二维及三维空间的变化，且还可利用其软件可得出定量测定曲线和数据[7]。利用激光共聚焦显微镜研究FRET有两类常用方法：即敏化发射和受体光漂白测量方法。

2.1 敏化发射方法

敏化发射测量方法其原理是在激发供体的情况下检测受体发射荧光的强度，其为FRET成像中简单直观的一种方法，适用于活细胞及荧光蛋白转染的细胞。实验前需构建荧光融合蛋白的重组载体，经酶切与测序鉴定正确后再进行共转染细胞，在其转染效率达到30%左右时进行测定[8]。在敏化发射方法中应注意两种干扰因素：①Bleed through，激发供体的同时受体受到激发而发光，激发受体的同时供体受到激发；②Cross-talk，激发供体时在受体通路检测到供体的发射光，激发受体时在供体通道检测到受体的发射光。可通过计算各个通道内的串扰因子系数，将总FRET信号按照系数减去一定比例的串扰因子，得到FRET效率。目前，有许多推荐的方法具体指导串扰因子的扣除[8]。

在实验中，除了测量待测FRET样本实验外，还需增加3个参考样本对系统进行串扰校正，即供体荧光团的供体对照样本、受体荧光团的受体对照样本和已知FRET效率的校正样本[9-10]。敏化发射方法也有其自身的限制，需要利用对照样本对光学检测系统以及荧光基团的光学性质进行事先校正，增加了实验的工作量和难度[11]。敏化发射方法适于检测固定细胞、活细胞和荧光蛋白转染的细胞。在实验中需注意，应去除光谱交叉和本底的影响，检测过程较繁琐，对样品要求较高(需要有双转、单转供体，单转受体样本)。

2.2 受体光漂白方法

受体漂白FRET(acceptor photobleaching FRET，apFRET)是一种检测FRET的方法，其基本原理是，如果2个荧光分子存在能量转移，对受体进行光漂白后其供体的荧光就会升高。通过检测供体荧光的增强来计算FRET效率，FRET效率以供体荧光增强的百分数表示(公式1)：

式中I和I′分别为漂白前和漂白后的供体的荧光强度[12]。

在共聚焦显微镜上容易实现受体光漂白方法操作，测量FRET效率既不依赖于系统参数，也不依赖于供体与受体的量子产率和消光系数，只依赖于受体光漂白前后供体的荧光强度变化。然而，受体光漂白会对生物体造成的损伤，不利于在单细胞中进行多次测量，也不能在细胞中进行实时动态检测[11]。

受体光漂白方法适于固定及免疫荧光标记的样品，其优点是可完全克服“bleed through”，“Crosstalk”(光谱渗透干扰)，因此不需要进行复杂校正，测量比较简便，容易获得实验结果；其缺点是因测量时需对受体荧光分子进行光漂白，如果样品是活细胞，在光漂白的过程中，被检测的分子会发生改变，所以只适合检测固定样品细胞内分子间相互作用。

3 FRET技术在实验中的应用

3.1 FRET荧光对的选择

在FRET体系中常用的荧光能量供体、受体对主要有CFP/YFP、BFP/GFP、GFP/RFP和CY3/CY5等[13-15]。目前，FRET技术需解决的问题是如何减少和排除非特异信号，提高对极低水平信号的探测[16]。而构建一个高效、特异的FRET探针并非易事，在研制荧光蛋白FRET探针过程中所面临的主要问题则在于如何提高探针在活细胞中检测的特异性和敏感性[17]。

选择FRET荧光对应遵循的原则：①供体的荧光量子产率(QD)要大；②供体和受体的光谱重叠积分J(λ)应尽可能大，即供体发射光谱与受体激发光谱应尽可能多的重叠(＞30%)；③供体和受体之间光谱干扰(cross-talk)要尽量小；④有较高的信噪比(S/B)；⑤能量供体受体对要有适度的光漂白性质，从而有利于用不同的方法检测FRET[18]。

由于在分子之间发生FRET的距离＜10 nm，FRET适合检测较小的蛋白质的相互作用[19-21]。

3.2 FRET技术的局限性

FRET技术受客观因素影响较多，如待测分子浓度、光漂白及激发光强度等，因此其重复性不够好。用FRET检测蛋白有相互作用，要求有较高的转染效率设置对照等要求。目前，分析蛋白质间的相互作用需要结合两种不同的方法相互取长补短才能得出一个科学的结论，通过结合FRET技术和免疫共沉淀技术能达到较理想的状态[22]。

3.3 FRET技术的应用范围

FRET的技术可用于检测酶活性变化、细胞凋亡的研究以及膜蛋白的研究[23]。激光共聚焦显微镜已成熟应用于原位鉴定细胞或组织内生物大分子，观察细胞及亚细胞形态结构等领域，许多有关蛋白分子的共定位、蛋白分子聚合体、转录机制和蛋白折叠等分子生物学问题均可通过FRET技术得到解决[24]。

4 FRET技术发展趋势

在发光源、高级成像技术和理论分析模型等领域的创新推动了FRET技术的发展，以稀土发光材料作为供体的共振能量传递(luminescence resonance energy transfer，LRET)以及基于能量供体和能量受体之间非放射性的能量转移的生物发光能量转移(bioluminescence resonance energy transfer，BRET)的研究方法也相继出现。今后随着各领域方法技术的日益交汇融合，以及新仪器的层出涌现，生命科学的分析测试能力将不断增强，为生命科学研究提供日益精尖的工具[16]。如FRET技术和荧光相关谱(fluorescence correlation spectroscopy，FCS)技术是两种可在活细胞中检测单分子行为的互补技术，FRET技术反映分子自身构像变化和分子间的空间距离变化，而FCS技术从分子荧光涨落中提取单分子的动态行为如浓度和扩散系数[25]。

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)及其变种的发现以及显微荧光技术的发展使得FRET技术在活细胞中的应用更加广泛[11]。荧光蛋白、有机染料以及半导体量子点在单分子荧光技术上均有应用。由于其光稳定性远强于荧光蛋白及有机荧光染料，半导体量子点作为一种新型的荧光探针正越来越广泛地被采用[26]。未来随着分子生物学的发展，测量仪器和技术方法的不断更新和改进，探针的改进及数据分析的改进，FRET技术将有很大的发展空间，FRET技术必将对生命科学的发展起到重大的推动作用。

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