哺乳动物防御素生物学研究进展

卢 顺，向 敏，高其双，黄海军，陈志华，周 莉，彭 霞，占才耀，夏 瑜，陶弼菲，华 娟，童伟文，王莲芳

（1.武汉市畜牧兽医科学研究所，湖北 武汉430208；2.华中农业大学动物医学院，湖北 武汉430070）

动物防御素是一类内源性阳离子短肽，广泛分布于包括人类在内的各种哺乳动物体内，具有广谱抗菌活性，又被称为抗菌肽(AMPS)。早在1963年，美国科学家Zeya等人在研究豚鼠白细胞裂解物时就发现该类具有抗菌活性的物质[1]。随后，人们在昆虫、鸟类、鱼类、两栖类、爬行类和哺乳类等动物体内均发现有防御素的存在。到目前为止，已从多种动物和人体内分离出百余种防御素。哺乳动物防御素的抗微生物机理独特，不易产生耐药性，是机体抵抗外来致病性微生物侵袭的重要武器。除了对细菌、真菌、支原体、衣原体、螺旋体和披膜病毒有毒杀作用外,哺乳动物防御素还对某些恶性肿瘤细胞有杀伤作用[2]，因此在新药研发方面具有较高的开发价值和良好的应用前景。近些年，国内外关于哺乳动物防御素的研究不断深入，并发现了一些新的生物学活性，对其作用机理也有了更准确的认识，下面对其研究进展作一概述。

1 哺乳动物防御素的种类及分布

根据氨基酸序列和分子结构的不同，哺乳动物防御素可以分为三大类：α-防御素、β-防御素和θ-防御素。α-防御素最早是在兔的肺泡巨噬细胞中发现的，随后在兔、鼠、豚鼠、短尾猿、人等多种哺乳动物的巨噬细胞、嗜中性粒细胞、小肠潘氏细胞（Paneth cell）中都有发现[3]，在哺乳动物的泌尿生殖道的上皮细胞、兔的肾脏内也有表达。β-防御素是Diamond等(1991)首先在牛的气管黏膜上皮细胞中发现的，在哺乳动物多种器官的上皮细胞内均有表达，例如牛、羊、猪、骆驼、驯鹿等动物的胃肠道、呼吸道、生殖道和舌，小鼠及大鼠的肾和肺，人的胃、气管、皮肤及其他黏膜上皮，以及牛的骨髓等[4]。在某些非上皮组织中，例如心脏、骨骼肌等，也有β-防御素的表达。θ-防御素发现较晚，存在于猕猴和狒狒的嗜中性粒细胞和单核细胞中，该防御素只在骨髓中有表达[5]。人和其他哺乳动物体内尚未发现有θ-防御素的表达。

2 哺乳动物防御素的分子结构特征

成熟的α-防御素是由29～36个氨基酸残基组成，因富含精氨酸而显碱性，分子内含有6个保守的半胱氨酸形成3对二硫键。核磁共振研究证实，α-防御素3对二硫键的连接位置分别为Cysl-Cys6，Cys2-Cys4，Cys3-Cys5，其中Cysl与Cys6的二硫键又分别连接N端和C端的半胱氨酸形成分子大环[6]。成熟的β-防御素由38～42个氨基酸残基组成，分子结构中也含有6个保守的半胱氨酸残基，但半胱氨酸的位置及相互连接形成二硫键的方式与α-防御素不同。β-防御素分子中二硫键连接方式为Cysl-Cys5、Cys2-Cys4、Cys3-Cys6[7]。θ-防御素是一种成环状结构的新型防御素，最先由Trabi等通过反向高效液相色谱技术(RP-HPLC)从猕猴的白细胞中分离得到[8]，其成熟肽由18个氨基酸残基组成，也含有3对二硫键。二硫键对维持防御素的稳定性和生物学活性起着重要作用。Yoshitha等（2011）发现，去掉1个二硫键后人α-防御素5对金黄色葡萄球菌的杀灭效果明显减弱，稳定性也随之下降[9]。Himanshu等（2012）在研究二硫键与人β-防御素4的活性时也得到了类似的结果[10]。

3 哺乳动物防御素的生物学活性

3.1 抗菌与抗病毒活性 哺乳动物防御素具有广谱的抗菌活性。无论是天然的还是某些人工合成的防御素，均表现出较好的广谱抗菌性能，对革兰阳性细菌、革兰阴性细菌、支原体、衣原体、螺旋体和真菌等具有杀灭或抑制作用，对某些披膜病毒如流感病毒、疱疹病毒和艾滋病病毒(HIV)等，也有很强的杀伤活性或抑制作用。人β-防御素3对金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌等革兰阳性致病菌，铜绿假单胞杆菌、大肠杆菌和放线菌等革兰阴性菌具有较强的杀伤作用[11]。人工合成的猪β-防御素在体外能够有效抑制大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌和枯草芽孢杆菌等[12]。从人体分离的多种防御素，例如α-防御素1～3等，均显示出抑制HIV-1复制的活性，但作用机理有所不同[13]。θ-防御素也具有抗菌和抗病毒作用，并且能在盐离子浓度较高的环境中保持活性[8，14]。

3.2 抗肿瘤及细胞毒性作用 哺乳动物的某些防御素能溶解肿瘤细胞或诱导细胞凋亡。除了抗肿瘤细胞以外，也有报道称有的防御素对培养的哺乳动物体细胞有细胞毒作用。防御素的细胞毒效应机理和抗肿瘤选择机理尚不十分清楚，一般认为是通过破坏癌细胞膜造成内容物外泄、亚细胞结构和DNA受损起作用，也有人认为与防御素的细胞毒性作用和刺激免疫因子产生等有关。体外试验表明，人α-防御素1能诱导肺腺癌细胞、口腔鳞状上皮癌细胞的溶解；人β-防御素1能诱导前列腺癌细胞凋亡[15]，对膀胱癌T24细胞也具有明显的体外抑制作用[16]。

3.3 免疫调节作用 哺乳动物防御素除了能直接杀死病原微生物外，也能在体内发挥免疫调节的作用。人β-防御素2能通过CCR6受体吸引T细胞、未成熟的树突状细胞和单核细胞聚集至炎症部位（趋化作用），诱发细胞免疫和体液免疫；人α-防御素1和α-防御素2可作为嗜中性粒细胞的趋化信号，还可诱导肥大细胞释放组胺[17]。鼠β-防御素2能趋化未成熟的树突状细胞，并能刺激IL-12和IFN-γ产生[18]。防御素的免疫调节作用对于机体的非特异性免疫非常重要，有助于提高机体的抗感染能力。有研究表明，β-防御素2表达水平较低的人群容易患慢性牙周炎[19]；血浆β-防御素3水平降低的骨折患者手术部位容易感染[20]。但并非所有的免疫调节作用都对机体有利，最近有研究表明，β-防御素的趋化作用也可促进某些肿瘤的生长[21]。

3.4 炎症反应和组织损伤修复 某些哺乳动物防御素能够增强巨噬细胞的吞噬能力，促进成纤维细胞的有丝分裂及炎症部位的组织修复。人防御素对单核细胞具有强效趋化作用，在炎症反应中作为嗜中性粒细胞的趋化信号，诱导单核细胞在病变部位聚集。在机体受到病原感染出现炎症时，某些种类的防御素表达上调，有助于机体对病原微生物的抵抗和杀灭。研究表明，用细菌的脂多糖刺激小鼠乳腺诱发乳腺炎，可导致小鼠乳腺中β-防御素1基因表达量增加[22]。人下呼吸道感染时，外周血β-防御素2水平显著上升[23]。

4 哺乳动物防御素的抗微生物机理

对于防御素抗菌活性的机制，大部分研究认为主要与防御素破坏细胞膜结构有关。通常认为，防御素发挥抗菌作用可分为3个阶段：(1)通过静电吸引，防御素与靶细胞膜结合。防御素带正电荷，可通过静电作用与带负电荷的细菌膜脂层结合；(2)在膜脂上形成通道。带正电荷的防御素分子或其多聚体与细菌质膜上带负电荷的磷脂头部和水分子相互作用，显著地增加生物膜的通透性。人工脂质膜试验显示，防御素能在膜上形成稳定的通道；(3)细菌内容物外泄。通道形成后，靶细胞的重要物质(如盐离子和大分子)渗出，致使靶细胞发生不可逆的损伤而死亡。大多数真菌、支原体、螺旋体等致病微生物的细胞膜也和细菌一样带有丰富的负电荷，所以也是防御素的攻击对象，而高等动物的细胞则由于细胞膜中负电荷含量较低而免受攻击。

近年来，随着研究的深入，有学者发现了防御素的一些新的抗菌机理。Vera等人在研究人β-防御素3对金黄色葡萄球菌的作用时发现，人β-防御素3在接近最小抑菌浓度时，并没有直接导致金黄色葡萄球菌的细胞膜穿孔和内容物外泄，而是通过与lipidⅡ结合抑制细胞壁肽聚糖的合成，导致细胞局部受损，进而引起整个菌体崩解[24]。越来越多的证据表明，防御素可通过多种途径起到抗菌作用，不仅仅是破坏质膜双分子层[25]。

哺乳动物防御素能杀灭或抑制一些披膜病毒和无包膜病毒，如疱疹病毒、艾滋病病毒、流感病毒和人乳头瘤病毒等[26]，目前已证明防御素可以3种不同的机制起到抗病毒的作用。第一种是通过直接与病毒粒子结合而起作用，例如防御素与包膜病毒结合，直接破坏病毒脂质包膜；第二种是抑制病毒的增殖，例如人α-防御素和β-防御素3能抑制靶细胞内蛋白激酶，从而达到抑制流感病毒基因复制及蛋白合成的目的；第三种是阻断病毒的侵染过程，例如人β-防御素2和β-防御素3能下调HIV病毒受体CXCR4的表达，阻止病毒进入细胞。许多哺乳动物防御素，如人α-防御素1～3、兔α-防御素2、人β-防御素3、鼠α-防御素1等已被验证能通过不同途径抑制病毒复制[27]。

5 哺乳动物防御素的应用前景

5.1 新型抗菌药物 哺乳动物防御素作为一种新型的抗菌肽，主要作用于病原菌的细胞膜，抗菌谱广，不易产生耐药性，有望取代部分抗菌药物在临床上使用。传统的抗菌药物大多作用于病原菌的酶系统，而酶基因的突变或代谢途径的改变易使病原菌对其产生耐药性。此外，抗菌药物残留也限制了常规抗菌药物在生产中的使用，比如鲜奶、猪肉的药物残留问题。如果能开发出用于杀灭病原菌的防御素药物产品，则能避免上述问题。目前国内市场上已有一些防御素产品销售，可用来提高生猪等的养殖效率。

5.2 新型抗肿瘤药物 已证明哺乳动物防御素可杀伤多种肿瘤细胞，如果能建立靶向性的防御素基因治疗方法，则可为肿瘤的防治提供新的途径。例如，将防御素与肿瘤特异性抗体偶联，可定向杀伤肿瘤细胞。传统的治疗肿瘤的方法是放疗和化疗，这两种方法对机体的副作用较大，在杀伤肿瘤细胞的同时，也杀伤或毒害正常细胞。防御素可直接杀伤肿瘤细胞或通过免疫途径杀伤肿瘤细胞，对机体正常细胞损害较小，因此在肿瘤治疗中更具优势。关于防御素抗肿瘤的研究多处于实验室研究阶段，尚未见到抗肿瘤的防御素药品推出。

5.3 抗病育种 哺乳动物防御素在抗病育种中的应用较少，主要是培育高效表达防御素的抗病新品种。周春江等（2003）将兔防御素NP-1基因转入到小麦中，得到具有抗白粉病、叶锈病和条锈病新植株[28]；2009年11月27日，人民日报报道我国著名胚胎工程专家、西北农林科技大学教授张涌历培育出转人防御素的基因克隆奶牛。这是世界首例转人防御素的基因克隆奶牛，它的诞生可能会对我国畜牧业的发展产生较深的影响。

6 结束语

虽然哺乳动物防御素在抗菌、抗病毒等方面显示出了无限的潜力，但是在临床应用上还存在一些问题，例如天然含量较少，分离纯化困难，人工合成成本高，临床应用的安全性等，这些都是有待解决的问题。随着研究的深入与人工合成技术的进步，人们对哺乳动物防御素的认识将越来越清楚，开发防御素制品的能力也会越来越强。目前，一些β-防御素类药品已进入临床试验阶段，有望作为替代品用于治疗细菌和病毒感染等。相信在不久的将来，防御素类药物就能广泛应用于疾病防治、科学研究和基因治疗等领域。

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