饲料中二恶英检测方法研究进展

李晓敏， 张庆华， 王 璞

（1.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京海淀 100081；2.中国科学院生态环境研究中心，北京海淀100085）

二恶英是多氯代二苯并-对-二恶英（PCDDs）和多氯代二苯并呋喃（PCDFs）两大类化合物的统称，是第一批被列入《斯德哥尔摩公约》的12种典型持久性有机污染物（POPs）中的两类，因具有强致癌性、生殖毒性、内分泌干扰毒性和生物蓄积性而备受关注（Johnson，1995）。

二恶英是工业生产过程中产生的副产物，主要来源于含氯化学品制造、市政垃圾焚烧、三废排放以及废旧电子垃圾拆解焚烧过程 （郑明辉等，1999），其结构稳定，难以降解，能通过各种途径进入食物链。由于二恶英毒性大，易在动物体内蓄积的特性，其在低浓度下也易对人类和动物产生健康影响，因此，在痕量水平上分析二恶英成为研究饲料中该类化合物的基础。

1 饲料中二恶英的分析方法及限量标准

二恶英前处理效果直接影响检测结果的灵敏度和准确性（Malavia等，2007）。如何从不同基质中分离二恶英并对其进行准确定性定量分析是开展该类化合物研究的基础。上世纪70年代末，基于同位素稀释-高分辨气相色谱/高分辨质谱（isotope dilution-HRGC/HRMS）的二恶英分析方法已趋于成熟，在测定一些痕量及超痕量浓度水平样品时，该方法是目前唯一具有法律效力的检测方法。我国正在运行的二恶英检测实验室大多采用欧美和日本等国家机构颁布的标准方法对二恶英进行分析检测，如USEPA 1613b被广泛用于检测环境、食品样品中痕量二恶英 （EPA，1994a），EN 1948用于检测飞灰中二恶英 （EN-1948-1，2，3：2006），USEPA 8290 用于检测固体废弃物中二恶英等（EPA，1994b）。

目前，我国也已制定基于同位素稀释-HRGC/HRMS的饲料中二恶英类化合物的检测方法，该方法涵盖众多饲料产品：包括饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、添加剂预混合饲料以及饲料添加剂等，已于2012年11月1日正式开始实施（GB/T 28643-2012）。

尽管目前对饲料中二恶英类化合物的检测方法仍以HRGC/HRMS方法为确证方法和主要方法，但在大量筛选样品时，为降低分析成本，一些实验室也采用生物方法进行初步判定。本文中介绍的前处理技术和检测方法也适用于多种基质，包括饲料、食品、环境基质、生物样品等。

1.1 二恶英前处理技术 二恶英分析难点在于其含量低（可达fg/g水平）、易受基质效应干扰，而饲料和生物组织基质复杂，干扰物众多，并且这些干扰物水平一般远高于目标化合物。在二恶英实际分析检测工作中常出现检测限高、回收率低的情况。此外，由于目前国际通用的HRGC/HRMS法中，高分辨质谱极易受到高浓度样品污染，因此，为得到更低的样品检出限，避免仪器污染和其他杂质干扰，二恶英的前处理过程要求极为严格。

索氏提取法是较为经典的持久性有机污染物提取方法，目前许多二恶英实验室仍然采用这种方法对样品进行萃取。随着前处理技术发展，其他新型样品提取方法，如加压液体萃取法（PLE）和微波辅助萃取法（MAE）等开始被广泛应用于多种样品基质的提取中 （Rawa-Adkonis等，2003）。

利用色谱填料法对样品进行预处理是常见的样品前处理净化技术。常见的二恶英前处理净化填料有：氧化铝、活性炭、硅胶、弗罗里土以及部分填料的变性材料等。USEPA 1613b方法对液体和固体样品、多重复杂基质样品和组织样品的前处理建立了详细流程，但同时指出，在保证质量的基础上，各实验室可对该方法进行改进或优化。此外，凝胶渗透色谱（GPC）经常被用于分离样品基质中的脂肪和大分子共流出干扰物（Zacs等，2013；Rossetti等，2012）；在一些复杂基质中，当2，3，7，8-位取代的同系物被干扰或者样品中存在难以通过色谱法去除的杂质时，通常采用HPLC（high-performance liquid chromatography）对样品进行进一步分离 （Engwall等，1997；EPA，1994a）；C18/硅胶填料的SPE柱可用于对生物基质样品的快速前处理净化（Chang等，1990）。除常见色谱填料外，浓硫酸常被用于去除提取物中的脂肪和其他有机干扰物，铜粉通常被用于去除提取物中的硫。

目前国际上已有全自动二恶英前处理设备。FMS公司开发的 fluid management systems（FMS）全自动净化系统，通过三根成品净化柱（硅胶柱、氧化铝柱和碳柱）的净化，实现二恶英类化合物（二恶英和多氯联苯）的分离，处理后的样品经浓缩后可直接进行HRGC/HRMS测定。该方法性能稳定、重现性好，满足USEPA 1613b标准的要求。同时，FMS前处理技术可大幅提高分析速度，使分析周期大大缩短。但这种方法存在仪器和耗材昂贵的缺点，而且受通道数量限制，一次性处理样品数量有限。

1.2 仪器检测方法

1.2.1 HRGC/HRMS 利用气相色谱/质谱联用（GC/MS）测定多种基质中的二恶英是分析这类化合物常见的方法（Katami等，2002；Roy 等，2002）。基于气相色谱的分离能力和质谱对特定离子的选择性，GC/MS方法要优于早期使用的其他方法（如GC/ECD、红外等）。但是，环境样品中毒性最强的二恶英单体 2，3，7，8-TCDD， 含量水平为ppt甚至ppq级别，受检测限限制，GC/MS仍然无法对其定性定量。Baughman和Meselson（1973）优化了二恶英前处理方法，利用HRMS对2，3，7，8-TCDD 进行检测，将检测限降到 1.0 ppt的水平。此后，同位素稀释-HRGC/HRMS方法被广泛应用于对环境样品（土壤、空气、水、底泥）、生物样品（组织、内脏、血液、胎盘、乳液）和食品中二恶英类化合物的检测（Hernandez等，2012），同时，该方法也被公认为二恶英检测的“黄金法则”。我国国标中对饲料中二恶英类化合物检测方法即采用此方法。

虽然HRGC/HRMS法可以实现二恶英单体的定性定量检测，但HRGC/HRMS法仍然存在一些缺点：如该方法的样品前处理过程复杂，检测周期长，对分析仪器、实验室环境和操作人员的要求较高，分析成本极为昂贵等。此外，由于二恶英化合物单体众多，且单体间物理化学性质极为相近，因此很难在一根色谱柱上实现所有单体的分离；与二恶英性质相近的多氯联苯（PCBs）、芳香烃类化合物也会对二恶英分析造成干扰。一般解决方法是先后利用多根不同性质的色谱柱重复进样，多次进行分析（EPA，1994a）。 一些常见的色谱柱，如 DB-5ms（5%苯基-95%二甲基聚硅氧烷）、DB-Dioxin（44%甲基-28%苯基-20%氰丙基聚氧硅烷-8%聚乙二醇）、SP 2331（100%氰丙基聚氧硅烷）以及与其涂层类似的色谱柱都可被用于分离二恶英不同单体（Eljarrat和 Barcelo，2002）。

1.2.2 其他仪器检测方法 为解决单根色谱柱分离二恶英共流出的现象，科研人员尝试利用具有高灵敏度的全二维气相色谱技术（GC×GC）分离检测二恶英类化合物 （Eljarrat和 Barcelo，2002）。GC×GC法能获得较窄的色谱峰谱图，该方法可提高柱效，减少分析时间，改善结构相似污染物色谱峰的分离度，提高污染物监测的准确性。同时，多种色谱柱交叉使用可避免复杂的色谱柱更换、重复进样操作 （Focant等，2004；Kemmochi等，2003）。因 GC×GC 系统需要配备快速检测器，因而一般与TOF/MS、ECD、MS等检测器连接（Eljarrat和 Barcelo，2002）。其中利用 GC×GC-TOF/MS系统对二恶英进行检测已有众多研究报道（Hoh 等，2008；Focant等，2005）。GC×GCTOF/MS的分辨率可达5000～7000，虽然低于HRMS，但可同时进行全扫描和选择离子扫描检测。虽然目前利用这种方法对二恶英检测还比较少见，但其操作简便，仍具有一定应用前景。受扫描速度限制，HRMS一般难与GC×GC匹配。但在最近一项研究中，Patterson等（2011）将GC×GC与高分辨质谱搭载对人体血清中二恶英进行分析，对HRMS参数进行优化，在保证仪器灵敏度的前提下减少质谱扫描时间，可得到血清样品中 1，2，3，7，8-PeCDD 单体（223 ag）的信噪比为 188∶1。

气相色谱-三重四级串联质谱法 （GC-MS/MS）也常被用于对二恶英类化合物的检测。由于该方法对前处理要求低于传统的HRGC/HRMS法，且具有优异的选择性和灵敏度，因此应用也较为广泛，尤其适用于一些含量较高的样品（Cunliffe 和 Williams，2006；Eppe 等，2004；Tondeu 等，1987）。 Malavia等（2007）利用 GC-MS/MS 测定植物油中的PCDD/Fs和PCBs，结果显示二恶英检测限可达到0.04～0.20 pg/g。但GC-MS/MS的检测限受基质干扰较大，当被用于测定土壤中PXDD/PXDFs（X=Br，Cl）时，检测限（3.8 ～ 44 pg/g）远高于 HRGC/HRMS的结果 （Myers等，2012）。GC-MS/MS与HRGC/HRMS方法相比较，具有更好的选择性，但其灵敏度要低于后者。

1.3 生物/免疫检测方法 传统仪器检测方法准确可靠，但前处理过程复杂、消耗大量化学试剂和耗材，分析成本高、周期长，无法同时处理大量样品。生物/免疫检测方法（Bioassay/Immunoassay methods）是针对传统仪器分析方法的缺点而发展起来的二恶英检测技术。Nebert（1972）提出二恶英类物质受体致毒机制以来，基于2，3，7，8位取代的二恶英单体与芳香烃受体（AhR）特异性结合的毒理学研究以及检测方法开发一直是该领域的研究热点。其原理是利用与二恶英具有特异性结合位点的抗体、受体、酶，借助其对二恶英化合物的识别能力，通过测定生物分子活化程度，从而间接确定二恶英毒性当量。生物/免疫检测方法的优点是检测时间短、操作简单、价格低廉，与同位素稀释/高分辨方法相比可将分析成本降低50%以上 （Reiner等，2006）。随着生物技术的快速发展，美国EPA已将几种生物检测方法推荐为指导方法。欧盟也将细胞的生物检测法（cel1-base bioassay）和利用试剂盒的生物检测法（kit-base bioassay）作为二恶英筛选方法（European Commission，2002a）。 生物法测试周期短，可平行测试大量样品，适于快速、大规模样品的筛选，缺点是只能测定总毒性当量（Behnisch等，2001a）。目前常见的二恶英生物检测方法包括：EROD酶 （7-乙氧基-3-异吩恶唑酮-脱乙基酶）活力诱导法、荧光素酶报告基因法（CALUX）、酶免疫分析法（EIA）、荧光免疫分析法（DELFIA）等（Behnisch 等，2001b）。

EROD酶与二恶英结合存在良好的时间-效应关系。当AhR与TCDD构成的复合体进入细胞核后，可与芳香烃受体核转位子蛋白再度结合并识别特定DNA片段，与之结合后可启动下游靶基因转录，激活EROD酶的活性。因此通过测定EROD酶活性可间接获得TCDD与AhR结合水平。研究表明，在一定范围内，EROD酶活与二恶英浓度呈线性关系。与免疫方法和荧光素酶方法相比，EROD法在测定CYP1A1基因催化活性时，结果更接近动物体内真实反应。作为较早开发的二恶英生物检测法，EROD应用较为广泛，如曾被用于研究雌雄鱼体肝脏组织中化合物二恶英暴露差异（balos等，2010），以及大鼠肝脏和脂肪组织中二恶英时间剂量代谢关系（Ábraham等，1988）。Schoffer等（2011）用 EROD（H4IIE 细胞株）法和HRGC/HRMS法测定鸡肉中二恶英，并用回归模型对其进行校正，结果显示该方法可被用于筛选动物产品中二恶英超标样品。但使用EROD方法易造成假阴性结果，其测定线性范围也较CALUX略窄（Behnisch 等，2001a）。

CALUX方法是目前发展较快的二恶英快速测定方法。与EROD方法相比，CALUX方法具有更高的灵敏度，且其检测的线性范围更宽，所需时间更短，目前已广泛用于对多种环境介质、生物样品和食品中二恶英的检测，适合大量样本的快速筛选。由于CALUX法是特异性测定样品中所有具有AhR受体的化合物，所以其受到的干扰较仪器分析法更为复杂，样品提取、净化以及样品基质均会给分析带来较大影响，一般CALUX得出的结果会高于仪器分析结果 （Windal等，2005）。 周志广等（2001）利用 CALUX 法测定废气中二恶英类化合物，并用HRGC/HRMS方法对分析结果进行校正，结果显示两种方法得出的数值相差较大，但是两种方法相关性良好（R2=0.9948）。

EIA法通过将特异性抗体与二恶英结合，将化合物固定在EIA管壁上，利用竞争酶与样品中二恶英共同竞争抗体的特异性结合位点的原理，以不同浓度二恶英为标准物质制作标准曲线，最终通过测定抗体与竞争酶的荧光强度反向推算二恶英浓度水平。该方法操作简便，价格低廉，可平行测定多个样品，有商品化的试剂盒，便于采集样品后在现场迅速完成测定。但该方法开发费用昂贵，非特异性干扰较多，无法获得化合物对生物活性的影响，而且对二恶英和多氯联苯需采取不同的EIA方法。

生物/免疫分析法的缺点主要表现在：（1）不能添加回收内标，因此无法计算回收率；（2）只能得到总TEQ数据，无法确知单体的含量和TEQ值；（3）生物/免疫法属于半定量方法，可能出现结果误判。在处理具有争议的结果时，仍须仪器方法进行确证。因此，生物/免疫法一般用于大量样品的筛选或含量较高的样品的测定以及无需对单体进行定量的情况。

2 研究前景

我国对二恶英类化合物的研究工作起步较晚，特别是对饲料和农产品中二恶英的研究较少，对复杂饲料基质中二恶英的检测尚需进一步研究。在对饲料中二恶英的检测方面，短期内，仍将以同位素稀释-高分辨气相色谱/高分辨质谱联用仪定性定量为主；生物检测方法因其低成本和高通量的特点，也将会日渐推广开来。从长远来看，一些新型仪器，如APGC（atmospheric pressure gas chromatography）-MS/MS等都具有较好的研发前景，极有可能以其相对低廉的成本和与高分辨磁质谱相似的灵敏度与分辨率逐渐在二恶英检测中得到应用。

[1]郑明辉，刘鹏岩，包志成，等.二恶英的生成及降解研究进展[J].科学通报，1999，44（5）：455 ～ 463.

[2]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 28643-2012[S].饲料中二噁英及二噁英类多氯联苯的测定同位素稀释-高分辨气相色谱/高分辨质谱法.北京：中国标准出版社，2012-07-31.

[3]周志广，任明，许鹏军，等.荧光素酶报告基因法测定废气中二噁英类物质[J].环境科学研究，2011，24：1416 ～ 1421.

[4] Ábalos M，Parera J，Rivera J，et al.PCDD/F and DL-PCB levels in meat from broilers and rabbits fed with fish-oil enriched feeds[J].Chemosphere，2010，78（2）：175 ～ 184.

[5]Abraham K，Krowke R，Neubert D.Pharmacokinetics and biological activity of 2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin [J].Archives of Toxicology，1988，62（5）：359 ～ 368.

[6]Baughman R，Meselson M.An analytical method for detecting TCDD（dioxin）：levels of TCDD in samples from Vietnam[J].Environmental Health Perspectives，1973，5：27 ～ 35.

[7]Behnisch P A，Hosoe K，Sakai S.Bioanalytical screening methods for dioxins and dioxin-like compounds-a review of bioassay/biomarker technology[J].Environment International，2001a，27（5）：413 ～ 439.

[8]Behnisch P A，Hosoe K，Sakai S.Combinatorial bio/chemical analysis of dioxin and dioxin-like compounds in waste recycling，feed/food，humans/wildlife and the environment[J].Environment International，2001b，27（6）：495 ～ 519.

[9]Chang R R，Jarman W M，King C C，et al.Bioaccumulation of PCDDs and PCDFs in food animals III：A rapid cleanup of biological materials using reverse phase adsorbent columns[J].Chemosphere，1990，20（7-9）：881 ～ 886.

[10]Cunliffe A M，Williams P T.Isomeric analysis of PCDD/PCDF in waste incinerator flyash by GC-MS/MS[J].Chemosphere，2006，62（11）：1846 ～ 1855.

[11]Eljarrat E，Barcelo D.Congener-specific determination of dioxins and related compounds by gas chromatography coupled to LRMS，HRMS，MS/MS and TOMS[J].Journal of Mass Spectrometry，2002，37（11）：1105 ～ 1117.

[12]Engwall M，Broman D，Naf C，et al.Dioxin-like compounds in HPLC-fractionated extracts of marine samples from the east and west coast of Sweden：Bioassay-and instrumentally-derived TCDD equivalents[J].Marine Pollutution Bulletin，1997，34（12）：1032 ～ 1040.

[13]EPA （Environmental Protection Agency）.EPA Method 1613[S].Revision B：Tetra-throu gh octachlorinated dioxins a nd furans by isotope dilution HRGC/HRMS，EPA 821-B94-0059.Washington，DC，US：US Environmental Protection Agency，1994a.

[14]EPA（Environmental Protection Agency）.EPA Method 8290[S].Polychlorinated dibenzodioxins and polychlorinated dibenzofurans by highresolution gas chromatography/high-resolution mass spectrometry，Revision 0.Washington，DC，US：US Environmental Protection Agency，1994b.

[15]Eppe G，Focant J F，Pirard C，et al.PTV-LV-GC/MS/MS as screening and complementary method to HRMS for the monitoring of dioxin levels in food and feed[J].Talanta，2004，63（5）：1135 ～ 1146.

[16]European Commission.Commission Directive 2002/69/EC of 26 July 2002 laying down the sampling methods and the methods of analysis for the official control of dioxins and the determination of dioxin-like PCBs in foodstuffs[S].Official Journal of the European Communities，2002a.

[17]European Standard，Stationary Source Emissions.EN-1948-1，2，3：2006[S].Determination of the Mass Concentration of PCDDs/PCDFs.European Committee for Standardization，Brussels，2006.

[18]Focant J F，Eppe G，Scippo M L，et al.Comprehensive two-dimensional gas chromatography with isotope dilution time-of-flight mass spectrometry for the measurement of dioxins and polychlorinated biphenyls in foodstuffs-Comparison with other methods[J].Journal of Chromatography A，2005，1086（1 ～ 2）：45 ～ 60.

[19]Focant J F，Sjödin A，Patterson Jr D G.Improved separation of the 209 polychlorinated biphenyl congeners using comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A，2004，1040（2）：227 ～ 238.

[20]Hernandez F，Sancho J V，Ibanez M，et al.Current use of high-resolution mass spectrometry in the environmental sciences[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry，2012，403（5）：1251 ～ 1264.

[21]Hoh E，Lehotay S J，Mastovska K，et al.Evaluation of automated direct sample introduction with comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry for the screening analysis of dioxins in fish oil[J].Journal of Chromatography A，2008，1201（1）：69 ～ 77.

[22]Johnson J.Dioxin Risk：Are We Sure Yet[J].Environmental Science and Technology，1995，29（1）：24 ～ 25.

[23]Katami T，Yasuhara A，Okuda T，et al.Formation of PCDDs，PCDFs，and coplanar PCBs from polyvinyl chloride during combustion in an incinerator[J].Environmental Science and Technology，2002，36（6）：1320 ～ 1324.

[24]Kemmochi Y，Tsutsumi K，Nakazawa H.Enhanced mass resolution tandem mass spectrometry method for 2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin detection with ion trap mass spectrometry using high damping gas pressure[J].Journal of Chromatography A，2003，1016（2）：249 ～ 256.

[25]Malavia J，Abalos M，Santos F J，et al.Analysis of polychlorinated dibenzo-p-dioxins，dibenzofurans and dioxin-like polychlorinated biphenyls in vegetable oil samples by gas chromatography-ion trap tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A，2007，1149（2）：321 ～ 332.

[26]Myers A L，Mabury S A，Reiner E J.Analysis of mixed halogenated dibenzo-p-dioxins and dibenzofurans （PXDD/PXDFs）in soil by gas chromatography tandem mass spectrometry （GC-MS/MS） [J].Chemosphere，2012，87（9）：1063 ～ 1069.

[27]Nebert D W G，Goujon F，Gielen J.Aryl hydrocarbon hydroxylase induction by polycyclic hydrocarbons：simple autosomal dominant trait in the mouse[J].Nature，1972，236（65）：107 ～ 110.

[28]Patterson Jr D G，Welch S M，Turner W E，et al.Cryogenic zone compression for the measurement of dioxins in human serum by isotope dilution at the attogram level using modulated gas chromatography coupled to high resolution magnetic sector mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A，2011，1218（21）：3274 ～ 3281.

[29]Rawa-Adkonis M，Wolska L，Namiesánik J.Modern Techniques of Extraction of Organic Analytes from Environmental Matrices[J].Critical Reviews in Analytical Chemistry，2003，33（3）：199 ～ 248.

[30]Reiner E J，Clement R E，Okey A B，et al.Advances in analytical techniques for polychlorinated dibenzo-p-dioxins，polychlorinated dibenzofurans and dioxin-like PCBs[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry，2006，386（4）：791 ～ 806.

[31]Rossetti G，Mosca S，Guerriero E，et al.Development of a new automated clean-up system for the simultaneous analysis of polychlorinated dibenzo-pdioxins （PCDDs），dibenzofurans （PCDFs）and'dioxin-like'polychlorinated biphenyls（dl-PCB）in flue gas emissions by GPC-SPE[J].Journal of Environmental Monitoring，2012，14（3）：1082 ～ 1090.

[32]Roy S，Mysior P，Brzezinski R.Comparison of dioxin and furan TEQ determination in contaminated soil using chemical，micro-EROD，and immunoassay analysis[J].Chemosphere，2002，48（8）：833 ～ 842.

[33]Schoffer J T，Bustos-Lopez C，Sotomayor P，et al.Application of the EROD-H4IIE bioassay for the determination of dioxins in broiler chicken meat：an equivalence study with high resolution gas chromatography coupled to high resolution mass spectrometry[J].Archivos de Medicina Veterinaria，2011，43（3）：259 ～ 266.

[34]Windal I，Denison M S，Birnbaum L S，et al.Chemically Activated Luciferase Gene Expression（CALUX）Cell Bioassay Analysis for the Estimation of Dioxin-Like Activity：Critical Parameters of the CALUX Procedure that Impact Assay Results[J].Environmental Science and Technology，2005，39（19）：7357～7364.

[35]Zacs D，Bartkevics V，Viksna A.Content of polychlorinated dibenzo-pdioxins，dibenzofurans.and dioxin-like polychlorinated biphenyls in fish from Latvian lakes[J].Chemosphere，2013，91（2）：179 ～ 186.