NADPH氧化酶激活机制和病理意义

张洁洁，彭 军

（中南大学药学院药理学系，湖南长沙 410078）

NADPH氧化酶激活机制和病理意义

张洁洁，彭 军

（中南大学药学院药理学系，湖南长沙 410078）

活性氧影响许多生理过程，包括宿主防御能力、激素合成和细胞内信号转导等。因活性氧过量而引起的氧化应激涉及高血压、动脉粥样硬化、糖尿病、心肌肥厚、心衰、缺血再灌注损伤、脑卒中和慢性肾病等许多疾病的发生和病理过程。NADPH氧化酶是机体促活性氧生成的主要酶类之一。NADPH氧化酶的激活很复杂，其活性受蛋白激酶、磷脂酶、肌动蛋白、皮质肌动蛋白（皮动蛋白）、冠蛋白和脂质筏等的调节。NADPH氧化酶活性的增高还涉及基因表达水平的上调。因此，阐明NADPH氧化酶活性调节机制将为心血管等疾病的药物防治提供新思路。本文就NADPH氧化酶活性调节机制研究进展作一综述

NADPH氧化酶；蛋白激酶；磷脂酶；肌动蛋白；皮动蛋白

DO l：10．3867／j．issn．1000-3002．2014．01．021

活性氧是指化学性质活泼、含有氧功能基团的化合物，包括超氧阴离子（）、过氧化氢羟自由基（·OH）、氢过氧化物（HOO·）和次氯酸（HOCl）等。研究表明，一定水平的活性氧对于维持机体正常的生理功能具有重要意义，而过量水平的活性氧则会对机体造成氧化损伤［1－2］。机体内产生活性氧的途径很多，其中包括线粒体呼吸链和促氧化酶类。NADPH氧化酶是机体促活性氧生成的主要酶类之一，其活性变化对局部组织器官乃至全身活性氧水平的高低具有重要影响，本文就NADPH氧化酶活性调节机制研究进展作一综述。

1 NADPH氧化酶的亚型、分布和生理功能

在哺乳动物中，已被确认的NADPH氧化酶的7个亚型分别是Nox1，Nox2，Nox3，Nox4，Nox5，Duox1和Duox2［3］。据报道，Nox1主要在结肠组织、HT29结肠的上皮细胞瘤细胞株［4］、子宫、前列腺以及血管平滑肌细胞中表达，其生理功能主要是细胞增殖以及血管原的转换器。Nox2主要在吞噬细胞、内皮和动脉外膜细胞中表达，其生理功能主要是免疫防御、氧感受器和血压调节。Nox3主要在内耳、胎肾以及癌症细胞系HepG2表达，其生理功能主要是影响胎肾的发育。Nox4主要在肾、内皮细胞、心脏、骨骼肌以及大脑中表达，其生理功能主要是红细胞生成素合成的调节和氧感受器。Nox5主要在淋巴组织和睾丸中表达，其生理功能主要是钙依赖性活性氧的产生。Duox1和Duox2主要在甲状腺、支气管、呼吸道上皮细胞中表达，其生理功能主要与甲状腺激素合成有关。

2 NADPH氧化酶的激活机制

NADPH氧化酶是一个包含膜结合细胞色素b558（p22phox和gp91phox异源二聚体）和细胞溶质调节蛋白（p67phox，p47phox，p40phox和Rac2 GTP酶）的多组分酶［5］，其激活机制很复杂，涉及到细胞溶质的p47phox，p67phox，Rac以及膜相关组分Nox2和p22phox的组装。

2．1 蛋白激酶与NADPH氧化酶的激活

多种蛋白激酶可通过蛋白磷酸化机制激活NADPH氧化酶。蛋白激酶C可通过磷酸化p40phox激活NADPH氧化酶［6］；一些丝氨酸激酶，如蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）及PKB和p21-激活蛋白激酶（p21-APK）则能够激活p47phox［7］；高氧激活肺内皮NADPH氧化酶则涉及p47phox的酪氨酸磷酸化，ERK和p38MAPK等激酶被报道介导了这一过程［8］。蛋白激酶激活NADPH氧化酶这一作用被相应抑制剂所证实，如PKC抑制剂GF109203X能够减弱p47phox和活性氧的产生［5］。JNK抑制剂SP600125则能抑制内毒素诱导的小神经胶质细胞中p47phox磷酸化［8］，而高氧诱导的p47phox的酪氨酸磷酸化则能够被Src抑制剂PP2减弱［6］。

肌球蛋白轻链激酶主要在调节肌球蛋白轻链磷酸化方面发挥作用。然而，近年来有文献报道，肌球蛋白轻链激酶在高氧诱导的皮动蛋白，Src和p47phox移位及活性氧的生成中起重要作用。与上述的蛋白激酶不同，肌球蛋白轻链激酶可能通过间接途径激活NADPH氧化酶。已知细胞支架蛋白肌动蛋白和肌球蛋白所组成的蛋白平台对NADPH氧化酶的集合和激活是必需的［9］，而肌球蛋白轻链激酶介导的肌球蛋白轻链磷酸化可影响该蛋白平台的构象变化进而激活NADPH氧化酶。

2．2 磷脂酶与NADPH氧化酶的激活

在完整的中性粒细胞中，特异性受体配体相互作用启动的信号转导通路可调节激活3种类型的磷脂酶：磷脂酶A2，磷脂酶C和磷脂酶D。磷脂酶A2激活后可释放花生四烯酸，它随后通过环氧化酶/脂氧合酶转化为氧化衍生物激活NADPH氧化酶；PIP2特异性磷脂酶C产生的甘油二酯能够激活PKC，进而通过磷酸化形式激活NADPH氧化酶［10］；磷脂酶D催化卵磷脂及其他膜磷脂水解为磷脂酸，磷脂酶D途径产生的磷脂酸及磷脂酸随后的代谢物甘油二酯调节吞噬性和非吞噬性NADPH氧化酶；组织和细胞通过磷脂酶D途径产生的磷脂酸能够激活蛋白激酶Cζ，进而磷酸化p47phox或p67phox或p22phox。磷脂酸能够调节NADPH氧化酶亚基和肌动蛋白结合蛋白之间的相互作用，从而改变肌动蛋白细胞骨架［11］。磷脂酶D介导的含有GTP酶激活蛋白1的IQ基序激活通过Rac1调节肺内皮细胞高氧诱导的p47phox易位以及活性氧的产生［12］。

2．3 肌动蛋白与NADPH氧化酶的激活

肌动蛋白是细胞支架的主要组分，在吞噬细胞和非吞噬细胞中大量出现。越来越多的研究表明，肌动蛋白在NADPH氧化酶的激活中起重要作用。细胞色素b558与肌动蛋白紧密相关，可与肌动蛋白和肌动蛋白相关蛋白共纯化。研究表明，肌动蛋白聚合和解聚能增加小胶质细胞中NADPH氧化酶的活性［13］；肌动蛋白与p47phox之间的相互作用能促进NADPH氧化酶的激活和活性氧的产生，这个过程依赖于Src介导的肌动蛋白的酪氨酸磷酸化以及Src和肌动蛋白的结合［12］；压力刺激血管平滑肌细胞时，抑制平滑肌22α表达将引起肌动蛋白细胞支架和微管骨架重构，从而导致线粒体故障和NADPH氧化酶激活［14］。

2．4 皮动蛋白、冠蛋白与NADPH氧化酶的激活

皮质肌动蛋白（皮动蛋白，cortactin）是一种肌动蛋白结合蛋白，它是c-Src信号通路的一个特异性下游靶点，在调节NADPH氧化酶集合中起重要作用。此外，皮动蛋白是公认的脚手架蛋白，能使肌动蛋白结合到细胞溶质的p47phox蛋白［15］。高氧可激活肺内皮细胞NADPH氧化酶并产生活性氧，这一过程由p47phox和皮动蛋白的Src依赖性酪氨酸磷酸化完成［9］。高渗血症可激活NADPH氧化酶，促进活性氧的形成，这一过程可能涉及到皮动蛋白磷酸化的增加［16］。

冠蛋白（coronin）是肌动蛋白结合蛋白的一高度保守家族，它调节肌动蛋白依赖的过程，如细胞运动和内吞作用［17］。冠蛋白与NADPH氧化酶的细胞溶质组分p40phox和p67phox相互作用，干预移位到吞噬体的过程［18］。在中性粒细胞中，磷酸化的p47phox蛋白使PKC适当定位，导致冠蛋白磷酸化，对NADPH氧化酶活性的调节具有正反馈作用［18］。

2．5 脂质筏与NADPH氧化酶的激活

脂质筏（lipid raft）是在应答刺激时，胆固醇、糖脂、磷脂和信号蛋白在细胞膜上聚集形成的物理信号平台。研究表明，脂质筏通过触发NADPH氧化酶关键亚基的集合在血管紧张素Ⅱ诱导的NADPH氧化酶激活中起重要作用［19］。脂质筏的一个完整组分小窝蛋白（caveolin）-1，在血管紧张素Ⅱ刺激血管平滑肌细胞后的Rac1和NADPH氧化酶的激活中是必要的。窝芽触发NADPH氧化酶后，NADPH氧化酶聚集在脂质筏［20］。有研究表明，白细胞介素1β具有刺激Nox2和白细胞介素1受体1从血浆膜进入早期内含体的共内吞作用，脂质筏可以维持它们在早期内含体内的完整性，NADPH氧化酶激活时，Nox2的组分（p47phox和p67phox）聚集到脂质筏［21］。

3 NADPH氧化酶表达的变化

NADPH氧化酶活性的增高还涉及基因表达水平的上调，如高胆固醇血症NADPH氧化酶亚基p67phox，p47phox和Nox2的表达上调［22］，而高血压和动脉粥样硬化等则Nox1和（或）Nox2 m RNA和蛋白表达增加［23］。最近的研究发现，心肌缺血再灌注时，Nox2基因表达显著上调，伴随活性氧水平升高，Nox4基因表达虽然有增加趋势，但未达到显著水平，提示Nox2在介导心肌缺血再灌注氧化损伤中起主要作用［24］；在氧化型低密度脂蛋白诱导的内皮细胞损伤中，NADPH氧化酶亚基gp91phox表达上调，通过NADPH氧化酶／活性氧／p38 MAPK／胱天蛋白酶3通路调节内皮细胞凋亡［25］。有关NADPH氧化酶基因表达调控机制则有待深入系统研究。

4 展望

NADPH氧化酶的过度激活是氧化应激水平升高的重要机制，与多种疾病的发生发展密切相关。因此，NADPH氧化酶抑制剂在抑制氧化应激方面具有潜在的临床应用价值。目前，已开发出多种NADPH氧化酶抑制剂，如二苯基氧化碘盐、夹竹桃麻素（apocynin）、gp91ds-tat和AEBSF等，但多数为非特异性抑制剂。最近有文献报道，新型NADPH氧化酶抑制剂VAS2870和VAS3947等为特异性抑制剂［26－27］，但其特异性程度还有待进一步证实。此外，抑制NADPH氧化酶基因表达是降低NADPH氧化酶活性的另一条途径，但这方面的进展还有赖于阐明NADPH氧化酶基因的表达调节机制。

［1］ Li TT，Peng J．Hypochlorous acid-mediated oxidative stress and its pathophysiological significance［J］．Chin J Pharmacol Toxicol（中国药理学与毒理学杂志），2010，24（4）：307-310．

［2］ Ma QL，Zhang GG，Peng J．Vascular peroxidase 1：a novel enzyme in promoting oxidative stress in cardiovascular system［J］．Trends Cardiovasc Med，2013，23（5）：179-183．

［3］ Cifuentes-Pagano E，Csanyi G，Pagano PJ．NADPH oxidase inhibitors：a decade of discovery from Nox2ds to HTS［J］．Cell Mol Life Sci，2012，69（14）：2315-2325．

［4］ Kim KA，Kim JY，Lee YA，Min A，Bahk YY，Shin MH．Entamoeba histolytica induces cell death of HT29 colonic epithelial cells via NOX1-derived ROS［J］．Korean J Parasitol，2013，51（1）：61-68．

［5］ TsaiYR，Wang YJ，Lee MR，Hsu MF，Wang JP．p38 Mitogen-activated protein kinase and extracellular signal-regulated kinase signaling pathways are not essential regulators of formyl peptide-stimulated p47（phox）activation in neutrophils［J］．Eur J Pharmacol，2013，701（1-3）：96-105．

［6］ Pendyala S，Usatyuk PV，Gorshkova IA，Garcia JG，Natarajan V．Regulation of NADPH oxidase in vascular endothelium：the role of phospholipases， protein kinases，and cytoskeletal proteins［J］．Antioxid Redox Signal，2009，11（4）：841-860．

［7］ Brandes RP，Weissmann N，Schröder K．NADPH oxidases in cardiovascular disease［J］．Free Radic Biol Med，2010，49（5）：687-706．

［8］ Jeong YH，Jung JS，Le TK，Kim DH，Kim HS．Lancemaside A inhibits microglial activation via modulation of JNK signaling pathway［J］．Biochem Biophys Res Commun，2013，431（3）：369-375．

［9］ Usatyuk PV，Singleton PA，Pendyala S，KalariSK，He D，Gorshkova IA，et al．Novel role for nonmuscle myosin light chain kinase（MLCK）in hyperoxia-induced recruitment of cytoskeletal proteins，NADPH oxidase activation，and reactive oxygen species generation in lung endothelium［J］．J Biol Chem，2012，287（12）：9360-9375．

［10］ Frey RS，Gao X，Javaid K，SiddiquiSS，Rahman A，Malik AB．Phosphatidylinositol 3-kinase gamma signaling through protein kinase Czeta induces NADPH oxidase-mediated oxidant generation and NF-kappaB activation in endothelial cells［J］．J Biol Chem，2006，281（23）：16128-16138．

［11］ Fa rquhar MJ，Powner DJ，Levine BA，W rightMH，Ladds G，Hodgkin MN．Interaction of PLD1b with actin in antigen-stimulated mast ce lls［J］．Cell Signal，2007，19（2）：349-358．

［12］ Usatyuk PV，Gorshkova IA，He D，Zhao Y，Kalari SK，Garcia JG，et al．Phospholipase D-mediated ac tivation of IQGAP1 through Rac1 regulates hyperoxia-induced p47phox translocation and reac tive oxygen species generation in lung endothelial cells［J］．J Biol Chem，2009，284（22）：15339-15352．

［13］ Rasmussen I，Pedersen LH，Byg L，SuzukiK，Sumimoto H，Vilhardt F．Effects of F／G-actin ratio and actin turn-over rate on NADPH oxidase activity in microglia［J］．BMC Immunol，2010，11：44．

［14］ Shen J，Yang M，Ju D，Jiang H，Zheng JP，Xu Z，et al．Disruption of SM22 promotes inflammation after artery injury via nuclear factor kappaB activation［J］．Circ Res，2010，106（8）：1351-1362．

［15］ Romero M，Jiménez R，Sánchez M，López-Sepúlveda R，Zarzuelo A，Tamargo J，et al．Vascular superoxide production by endothelin-1 requires Src nonreceptor protein tyrosine kinase and MAPK activation［J］．Atherosclerosis，2010，212（1）：78-85．

［16］ Cantore M，Reinehr R，Sommerfeld A，Becker M，Häussinger D．The Src family kinase Fyn mediates hyperosmolarity-induced Mrp2 and Bsep retrieval from canalicular membrane［J］．J Biol Chem，2011，286（52）：45014-45029．

［17］ Usatyuk PV，Burns M，Mohan V，Pendyala S，He D，Ebenezer DL，etal．Coronin 1B regulates S1P-induced human lung endothelial cell chemotaxis：role of PLD2，protein kinase C and Rac1 signal transduction［J］．PLoS One，2013，8（5）：e63007．

［18］ Shevchuk O，Batzilla C，Hägele S，Kusch H，Engelmann S，Hecker M，et al．Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium［J］．Int J Med Microbiol，2009，299（7）：489-508．

［19］ Jin S，Zhang Y，Yi F，Li PL．Critical role of lipid raft redox signaling platforms in endostatin-induced coronary endothelial dysfunction［J］．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2008，28（3）：485-490．

［20］ Rossard S，Roblin G，Atanassova R．Ergosterol triggers characteristic elicitation steps in Beta vulga ris leaf tissues［J］．J Exp Bot，2010，61（6）：1807-1816．

［21］ Oakley FD，Smith RL，Engelhardt JF．Lipid rafts and caveolin-1 coordinate interleukin-1beta（IL-1beta）-dependent activation of NF-kappaB by controlling endocytosis of Nox2 and IL-1beta receptor 1 from the plasma membrane［J］．J Biol Chem，2009，284（48）：33255-33264．

［22］ Musicki B，Liu T，Lagoda GA，Strong TD，Sezen SF，Johnson JM，et al．Hypercholesterolemiainduced erectile dysfunction：endothelial nitric oxide synthase（eNOS）uncoupling in the mouse penis by NAD（P）H oxidase［J］．J Sex Med，2010，7（9）：3023-3032．

［23］ Montezano AC，Touyz RM．Reactive oxygen species and endothelial function－role of nitric oxide synthase uncoupling and Nox family nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases［J］．Basic Clin Pharmacol Toxicol，2012，110（1）：87-94．

［24］ Zhang YS，He L，Liu B，Li NS，Luo XJ，Hu CP，et al．A novel pathway of NADPH oxidase／vascular peroxidase 1 in mediating oxidative injury following ischemia-reperfusion［J］．Basic Res Cardiol，2012，107（3）：266．

［25］ Bai YP，Hu CP，Yuan Q，Peng J，Shi RZ，Yang TL，etal．Role of VPO1，a newly identified hemecontaining peroxidase，in ox-LDL induced endothelial cell apoptosis［J］．Free Radic Biol Med，2011，51（8）：1492-1500．

［26］ Kleniewska P，Piechota A，Skibska B，Gorąca A．The NADPH oxidase family and its inhibitors［J］．Arch Immunol Ther Exp（Warsz），2012，60（4）：277-294．

［27］ Wind S，Beuerlein K，Eucker T，Müller H，Scheurer P，Armitage ME，etal．Comparative pharmacology of chemically distinct NADPH oxidase inhibitors［J］．Br J Pharmacol，2010，161（4）：885-898．

Mechanism s and pathological significance of activation of NADPH oxidase

ZHANG Jie-jie，PENG Jun
（Department of Pharmacology，School of Pharmaceutic Science，Central South University，Changsha 410078，China）

Reactive oxygen species（ROS）affect many physiological processes including host defense，hormone biosynthesis and cellular signaling．Over-production of ROS（referring to oxidative stress）is involved in various pathological processes including multiple diseases，such as atherosclerosis，cardiac hypertrophy，ischemia-reperfusion injury，hypertension，diabetes，stroke and heart failure．NADPH oxidase（Nox）is one of the major enzymes to promote the generation of ROS．The mechanisms for activation of Nox are very complicated，which are regulated by multiple factors such as protein kinases，phospholipases，actin，cortactin，coronin，and lipid rafts．The increase of gene expression is also involved in Nox activation．Therefore，elucidation of the regulatory mechanisms for Nox activation will provide new insights into the prevention and therapy of cardiovascular diseases．

NADPH oxidase；protein kinases；phospholipases；actin；cortactin

PENG Jun，E-mail：Junpeng＠csu．edu．cn，Tel：（0731）82355080

R363

A

1000-3002（2014）01-0139-04

Foundation item：The project supported by Doctoral Fund of Ministry of Education of China（20120162110056）；and Hunan Provincial Natural Science Foundation of China（13JJ2008）

2013-06-17 接受日期：2013-08-20）

（本文编辑：乔 虹）

教育部博士点基金（20120162110056）；湖南省自然科学基金重点项目（13JJ2008）

张洁洁（1987－），女，硕士研究生，研究方向为心血管药理学，E-mail：zhangjie＿jie198825＠126．com；彭 军（1968－），男，教授，博士生导师，主要从事心血管药理学研究。

彭 军，E-mail：junpeng＠csu．edu．cn，Tel：（0731）82355080；Fax：（0731）82355078