免疫学检测技术在真菌毒素及兽药残留检测中的应用

张勇法， 杨建英

（1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳 471023；2.河南科技大学医学技术与工程学院，河南洛阳 471023）

免疫学检测技术是利用抗原和抗体间的特异性反应，来识别和测定作为待测物的抗体/抗原，既能够用于样品的常规分析，也能够用于样品的定性筛选和定量测定。免疫学检测技术具有灵敏度高、特异性强、方便、快速和经济性等优点，在真菌毒素或兽药残留检测中发挥着重要的作用。目前常用的免疫学检测技术主要有放射免疫检测技术、酶联免疫检测技术、化学发光免疫检测技术、电化学免疫检测技术、基于量子点的荧光免疫检测技术及时间分辨荧光免疫检测技术、抗体微阵列、免疫传感器和胶体金免疫检测技术等（Meng和Xi，2011）。本文对上述免疫检测技术的优缺点及其在真菌毒素或兽药残留检测中的应用作一综述。

1 放射免疫检测技术

放射免疫检测技术 （RIA）的优点是灵敏度高、特异性强、精确性好、试剂价格低廉、样品用量少。缺点是其放射性对人体及环境均有危害、对仪器设备要求高、半衰期较短、容易造成污染。周浩等（2012）用RIA法对蜂蜜中四环素类抗生素残留量进行检测，其结果与LC-MS法验证的结果符合率达到100%，并与其他族抗生素无交叉反应。闫磊等（2010）采用RIA法对牛奶中的黄曲霉毒素含量进行大批量初步筛选，检出限（LOD）达到0.25 μg/kg。Al-Mazeedi等（2010）采集市场上奶制品、鸡蛋、动物组织等样品，用RIA法检测其四环素残留量，并用LC/MS/MS法验证，二者结果吻合度达80%～100%。

2 酶联免疫检测技术

酶联免疫检测技术（ELISA）的优点是操作简单、成本低、可批量检测样品、稳定性好、有效期长。但其灵敏度不够高，只能定性或半定量。Ji等（2011）采用ELISA法监测小麦粉中呕吐毒素（脱氧雪腐镰刀菌烯醇，DON）的含量，最低检出限为0.02 μg/mL， 平均回收率达82% ～93%。Liu等（2010）采用间接竞争ELISA法检测鸡肉和肝脏组织中氯丙嗪的残留量，实验结果可靠。刘百红等（2008）用建立的直接竞争ELISA法快速检测猪肉等动物源性食品中磺胺嘧啶残留，结果与同类英国RANDOX试剂盒符合率达到100%。

3 基于量子点的荧光免疫检测技术

基于量子点的荧光免疫检测技术（QIA法）具有灵敏度高、特异性好、操作简单快捷，便于推广等优点，但其非特异性吸附问题很难解决。李园园等（2012）建立了间接竞争QIA法检测花生中黄曲霉毒素B1，其灵敏度为0.023 ng/mL，检出限为0.001 ng/mL，与传统有机染料FITC二抗法相比，灵敏度可提高30倍。杨淑平等（2011）利用QIA法检测小麦面粉中DON的含量，其检出限为0.038 ng/mL，其灵敏度远高于已报道的气相色谱/电子捕获检测法 （GC/ECD）、高效液相色谱法（HPLC）和高效液相色谱-质谱联用法（HPLC/MS）。Chen等（2009）建立了QIA法检测鸡肉中恩诺沙星的残留量，检出限为2.5 ng/mL，加标回收率为81%～94%，与ELISA法和HPLC法的检测结果相关性很好。

4 时间分辨荧光免疫检测技术

时间分辨荧光免疫检测技术（TR-FIA）优点是操作便捷、灵敏度高、特异性好、无污染、重复性好，易于自动化操作；然而对测试环境要求高、成本也高。但目前仍是最灵敏的微量分析技术，广泛应用于生物学研究、临床疾病诊断、食品安全及环境监测等领域。Oku等（2011）为了监测黑牛的发情周期，采用TR-FIA法检测其牛奶和血浆中孕酮浓度，检出限为1.53 ng/mL，加标回收率为86.5%～98.6%，批间与批内变异系数分别为7.51%、5.46%。杨润琳等（2010）建立了T-2毒素间接竞争TR-FIA法，该方法灵敏度为0.2 pg/L，批间与批内变异系数分别为12.7%和7.5%，加标回收率为89.6%，与ELISA试剂盒检测结果对比，相关系数达到92.6%。黄飚等（2008）建立了高灵敏度的赭曲霉毒素A的TR-FIA法，分别检测了玉米和大麦等样品中赭曲霉毒素A的含量，其灵敏度达到0.02 μg/L，平均回收率为95.8%，批间与批内变异系数分别为2.6%和5.2%。

5 化学发光免疫检测技术

化学发光免疫检测技术（CLIA）优点是特异性好、灵敏度高、检测范围宽、无污染、有效期长、便于自动化操作。但对操作时间要求苛刻，否则工作曲线会发生漂移。主要用于临床分析、环境监测和药物及食品检测领域。Fang等（2011）建立了CLIA法，用来测定农产品中残留的黄曲霉毒素Bl，检测灵敏度达到0.01 ng/g，加标回收率为79.8%～115.4%，批间和批内变异系数分别小于10.0%和12.2%，与商品化的ELISA试剂盒验证结果相比，二者相关系数达0.9098。张慧丽等（2011）用CLIA法快速检测牛奶中恩诺沙星的残留量，其检出限为239.9 pg/mL，加标回收率为99.0%～101.4%，批间和批内变异系数均小于15%。邱云青等（2010）建立的快速灵敏CLIA法检测玉米粉中赭曲霉毒素的残留量，检出限为0.02 ng/mL，加标回收率为83.6%～105.8%。

6 电化学免疫检测技术

电化学免疫检测技术（ECLIA）优点是灵敏度高、特异性强、操作便捷、安全可靠、适合大规模生产，尤其适用于微量样品的检测，但特异性较差。李利军等（2009）建立了一种ECLIA法用于测定尿液中盐酸氯丙嗪含量，其检出限为6.0×10-7mol/L，加标回收率为97% ～107%。Liang等（2008）建立了一种ECLIA法用于检测睾酮含量，检出限为0.1 ng/mL。蓝苏梅等（2009）建立了一种ECLIA法测定胶囊中盐酸克林霉素含量，检出限为1.0×10-7mol/L，加标回收率为93%～102%。

7 抗体芯片检测技术

抗体芯片也称免疫芯片，其优点操作简单快捷、生产成本低、信息量大、用途广泛、自动化程度高等，缺点是单克隆抗体不易获得，被检标本中的抗原或抗体含量较低难进行体外扩增或浓缩，芯片的封装和储存条件苛刻，对于分子量和浓度范围极广的待检物难于定量分析等。Wang等（2012）将真菌毒素（如黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1、呕吐毒素、赭曲霉毒素A、T-2毒素、玉米烯酮）与牛血清白蛋白偶联，建立间接竞争抗体芯片检测技术，加标回收率为80%～120%，其最低检测浓度分别是 0.01、0.24、15.45、15.39、0.05、0.01 ng/mL。Zhong等（2010）通过抗体芯片检测技术检测鸡肉组织中克伦特罗的残留量，与间接ELISA方法相比加标回收率升高了14%，达到90%。

8 免疫传感器

免疫传感器优点是灵敏度较高、样品需要量少、样品无需处理、实时连续监测、操作简单快捷、应用范围广。缺点是成本高、非特异性强、对温度、样品组成等敏感，影响实验结果。在食品安全、临床诊断、环境监测、真菌毒素或兽药残留检测等领域应用广泛。Li等（2012）报道利用表面等离子体共振传感器法 （SPR）检测真菌毒素，其中DON的检出限达0.5 ng/g，HT-2毒素在早餐谷类、小麦和婴儿食品中的检出限分别达到 25、26、25 μg/kg。Dumont等（2006）用SPR检测了虾肉组织中4种抗生素：甲砜霉素（硫霉素）、氟苯尼考（氟洛芬，氟甲砜霉素）、氟苯尼考胺和氯霉素的残留，最低检测浓 度 分 别 是 0.1、0.2、250、0.5 ppb。 Haughey 等（2001）报道了利用免疫传感器法检测牛尿中克伦特罗的残留量，操作时间仅7 min，检出限为0.27 ng/mL，回收率在95%左右，批间和批内变异系数分别为9.2%～12.7%和4.7%～7.6%。

9 胶体金免疫层析法

胶体金免疫层析法（GICA）具有操作简单快速、设备简单、无污染、肉眼直接观察结果、便于携带等优点，不过只能用于定性（仅限阴性和阳性之分）及半定量分析（仅能把待测物含量确定于某一范围）。Xu等（2010）通过胶体金免疫试纸条法快速检测小麦和玉米中DON的残留量，检出限为50 ng/mL，并用气相色谱/质谱（GC/MS）法验证，二者具有很好的相关性。Zhu等（2008）利用胶体金免疫试纸条法10 min内检测了12种氟喹诺酮类药物，其中2种药物的检出限为25 ng/mL，其余10种为50 ng/mL。陈义强等（2009）通过胶体金免疫层析法对样品进行现场快速筛选，仅10 min可完成操作，并与传统的ELISA法和HPLC法结果对比，三者的测定结果完全相符。

10 小结

真菌毒素和兽药残留与食品安全息息相关，研究其相应的检测技术显得尤为重要。免疫检测技术的研究是当前检测与诊断科学技术领域里最为活跃的分支，因此，本文分别分析了多种免疫学检测技术的优缺点及使用情况，为寻找准确、灵敏、经济、高效的检测方法，保证食品安全，确保人民健康奠定了坚实的理论基础。

[1]陈义强，肖希龙，李德发.猪组织中卡那霉素残留胶体金免疫层析、ELISA及HPLC检测方法研究[A].中国畜牧兽医学会，中国畜牧兽医学会2009学术年会论文集（上册）[C].北京：中国畜牧兽医学会，2009.284～288.

[2]黄飚，时瑾，朱岚，等.赭曲霉毒素A时间分辨荧光免疫分析法的建立及其考核[J].标记免疫分析与临床，2008，15（3）：174 ～ 177.

[3]蓝苏梅，李利军，蔡卓，等.联吡啶钌体系电化学发光法测定克林霉素的研究[J].分析测试学报，2009，28（4）：466 ～ 469.

[4]李利军，陈昌东，程吴，等.盐酸氯丙嗪.联吡啶钌体系在多壁碳纳米管修饰电极上的电化学发光行为研究及盐酸氯丙嗪的测定[J].分析测试学报，2009，28（1）：37 ～ 43.

[5]李园园，李培武，张奇，等.量子点标记荧光免疫法检测花生中黄曲霉毒素 B1[J].中国油料作物学报，2012，34（4）：438 ～ 442.

[6]刘百红，熊宁，王喜亮，等.直接竞争ELISA法快速检测动物源性食品中磺胺嘧啶残留[J].中国兽药杂志，2008，42（2）：16 ～ 19.

[7]邱云青，王伟，李凤琴.化学发光酶免疫分析法检测食品中赭曲霉毒素[J].食品科学，2010，31（24）：432 ～ 435.

[8]闫磊，李卓，张燕.牛奶中黄曲霉毒素的放射免疫法检测[J].食品研究与开发，2010，31（1）：135 ～ 137.

[9]杨润琳，计融，江涛，等.T-2毒素的高灵敏时间分辨荧光免疫分析[J].食品与机械，2010，26（1）：74 ～ 76.

[10]杨淑平，金鑫，郑佳，等.高性能CdTe/CdS核壳型量子点的制备及应用于小麦面粉中呕吐毒素的荧光免疫检测研究[J].化学学报，2011，69（6）：687～692.

[11]张慧丽，于斐，吴拥军，等.化学发光酶免疫分析法快速测定牛奶中恩诺沙星的含量[J].中国食品卫生杂志，2011，23（5）：398 ～ 401.

[12]周浩，李俊霞，杨红，等.蜂蜜中四环素类抗生素的放射免疫法检测[J].食品研究与开发，2012，33（11）：160 ～ 162.

[13]Al-Mazeedi H M，Abbas A B，Alomirah H F，et al.Screening for tetracycline residues in food products of animal origin in the State of Kuwait using Charm II radio-immunoassay and LC/MS/MS methods[J].Food Addit Contam A，2010，27（3）：291 ～ 301.

[14]Chen J X，Xu F，Jiang H Y，et al.A novel quantum dot-based fluoroimmunoassay method for detection of Enrofloxacin residue in chicken muscle tissue[J].Food Chem，2009，113（4）：1197 ～ 1201.

[15]Dumont V，Huet A C，Traynor I，et al.A surface plasmon resonance biosensor assay for the simultaneous determination of thiamphenicol，florefenicol，florefenicol amine and chloramphenicol residues in shrimps[J].Anal Chim Acta，2006，567（2）：179 ～ 183.

[16]Fang L，Chen H，Ying X，et al.Micro-plate chemiluminescence enzyme immuneoassay for aflatoxin B1in agricultural products[J].Talanta，2011，84（1）：216～222.

[17]Haughey S A，Baxter G A，Elliott C T，et al.Determination of Clenbuterol Residues in Bovine Urine by Optical Immunobiosensor Assay[J].J AOAC Int，2001，84（4）：1025 ～ 1030.

[18]Ji F，Li H，Xu J，et al.Enzyme-Linked Immunosorbent-Assay for Deoxynivalenol（DON）[J].Toxins，2011，3（8）：968 ～ 978.

[19]Li Y，Liu X，Lin Z.Recent developments and applications of surface plasmon resonance biosensors for the detection of mycotoxins in foodstuffs[J].Food Chem，2012，132（3）：1549 ～ 1554.

[20]Liang K Z，Qi J S，Mu W J，et al.Biomolecules/gold nanowires-doped sol-gel film for label-free electrochemical immunoassay of testosterone[J].J Biochem Bioph Meth，2008，70（6）：1156 ～ 1162.

[21]Liu W，Li W，Yin W，et al.Preparation of a monoclonal antibody and development of an indirect competitive ELISA for the detection of chlorpromazine residue in chicken and swine liver[J].J Sci Food Agr，2010，90（11）：1789～1795.

[22]Meng M，Xi R.Review：Current Development of Immunoassay for Analyzing Veterinary Drug Residue in Foods and Food Products[J].Anal Lett，2011，44（15）：2543 ～ 2558.

[23]Oku Y，Osawa T，Hirata T，et al.Validation of a direct time-resolved fluoroimmunoassay for progesterone in milk from dairy and beef COWS[J].Vet J，2011，190（2）：244 ～ 248.

[24]Wang Y，Liu N，Ning B，et al.Simultaneous and rapid detection of six different mycotoxins using an immunochip[J].Biosens Bioelectron，2012，34（1）：44 ～ 50.

[25]Xu Y，Huang Z B，He Q H，et al.Development of an immunochromatographic strip test for the rapid detection of deoxynivalenol in wheat and maize[J].Food Chem，2010，119（2）： 834 ～ 839.

[26]Zhong L，Zhang W，Zer C，et al.Protein microarray：sensitive and effective immuno detection for drug residues[J].BMC Biotechnol，2010，10：12.

[27]Zhu Y，Li L，Wang Z，et al.Development of an immunochromatography strip for the rapid detection of 12 fluoroquinolones in chicken muscle and liver[J].J Agric Food Chem，2008，56（14）：5469 ～ 5474.■