bFGF抑制自噬相关蛋白LC3保护大鼠急性脊髓损伤

张 谢，宋毓飞，周 华，祁 峰，王丹萍，章雅丹，张宏宇，肖 健

（宁波市医疗中心李惠利医院1.消化内科、2.药剂科、3.骨科，浙江宁波 315040；4.宁波大学医学院，浙江宁波 315211；5.温州医科大学药学系，浙江 温州 325035）

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）的治疗一直是神经损伤修复领域的医学难题，其致残率与致死率非常高。自噬（autophagy）是一种细胞通过溶酶体降解途径调控的细胞器和蛋白循环过程，其与衰老、免疫、细胞死亡和分化有关［1］。碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）具有促进血管生成、神经保护、轴突再生、组织修复等作用。故本文研究bFGF与细胞自噬相关蛋白LC3在脊髓损伤修复过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 重组 bFGF（Grost）；LC3Ⅱ、LC3Ⅰ（Danvers）；anti-mouse IgG HRP（Santa Cruz）。

1.2 SCI动物模型制备及给药 SD大鼠随机分为假手术组（sham）、模型组（SCI）与bFGF给药组。10%水合氯醛麻醉，血管夹夹住T9脊髓2 min。bFGF给药组，SCI后立即皮下注射80μg·kg－1重组bFGF，之后每天给予同剂量至处死。SCI组注射同剂量0.9%NaCl。

1.3 BBB评分 用 BBB评分法［2］于术后 1、3、7 d独立观察大鼠双后肢行动功能，并记录分数（后肢全部瘫痪为0分，完全正常行走为21分）。

1.4 Western blot检测 取脊髓损伤段0.1 g，加入1ml裂解液，取上清提取蛋白。LC3Ⅱ、LC3Ⅰ（1∶1 000）4℃孵育过夜，anti-mouse IgG HRP（1∶2 000）室温孵育 2 h，曝光，观察。

1.5 免疫荧光染色法 用10%驴血清室温孵育1 h，LC3（1∶500）4℃孵育过夜，anti-mouse IgG HRP（1∶500）室温孵育1 h，洗涤，观察。

1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理，数据以x¯±s表示。采用配对t检验。

2 结果

2.1 BBB评分 BBB评分结果显示，术后1 d，SCI组和bFGF组BBB评分差异无显著性；术后3 d，bFGF组BBB评分（6.3±0.6）高于 SCI组（2.7±0.7），P＜0.05；术后7 d，bFGF组大鼠可持续性前后肢协调行走（8.7±0.5），而SCI组大鼠后肢仍旧不能负重走动（5.7±0.7），P＜0.05。

2.2 bFGF通过抑制自噬相关蛋白LC3保护大鼠脊髓损伤

免疫荧光染色术后7 d结果显示，与sham组相比，LC3蛋白在SCI组织中明显增多，给予bFGF后下降。Western blot结果显示，术后7 d，SCI组LC3Ⅱ表达及 LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比值明显上升；但是此效果给予bFGF后明显抑制。

3 讨论

目前研究认为SCI产生两种机制，即原发性损伤机制和继发性损伤机制。继发性损伤是指在原发性损伤后发生的一系列病理生理改变，包括组织缺血、缺氧、炎症反应和组织水肿，最终导致细胞凋亡［3］。

自噬作为一种早期的自我适应性机制，能清除受损的细胞器和蛋白，为组织稳态的恢复提供营养物质和能量。近期的研究表明，在受压迫性损伤的脊髓组织中，自噬标志蛋白LC3明显增加；应用缺氧条件模拟脊髓损伤，也能够检测到脊髓神经元中LC3表达升高［4］。本文应用重组bFGF于大鼠急性SCI模型中，同样也发现脊髓损伤后LC3表达增加，给予bFGF后，表达下降。研究表明，bFGF能够通过抑制自噬相关蛋白LC3促进SCI大鼠后肢功能恢复，这对于开拓新的生长因子类药物在脊髓损伤中的应用有着重要的意义，相关研究国内还未见报道。

参考文献：

［1］ Meschini S，Condello M，Lista P，et al.Autophagy：molecular mechanisms and their implications for anticancer therapies［J］.Curr Cancer Drug Targets，2011，11（3）：357－79.

［2］ Basso D M，Beattie M S，Bresnahan J C.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats［J］.J Neurotrauma，1995，12（1）：1－21.

［3］ Moon Y J，Lee JY，Oh M S，et al.Inhibition of inflammation and oxidative stress by Angelica dahuricae radix extract decreases apoptotic cell death and improves functional recovery after spinal cord injury［J］.J Neurosci Res，2012，90（1）：243－56.

［4］ Tanabe F，Yone K，Kawabata N，et al.Accumulation of p62 in degenerated spinal cord under chronic mechanical compression：functional analysis of p62 and autophagy in hypoxic neuronal cells［J］.Autophagy，2011，7（12）：1462－71.