CD4+CD25highCD127low/-调节性T细胞在多发性骨髓瘤患者外周血的表达

高 鹏 王雪野 肖中平 付 堃 孔令环 王雪梅 李凌君 封 韬 韩 梅

(吉林省人民医院血液科，吉林 长春 130021)

多发性骨髓瘤(MM)好发于老年人，是一种单克隆浆细胞恶性增殖的血液系统恶性肿瘤，我国MM发病率约为1/10万。多种免疫缺陷影响抗肿瘤免疫应答和免疫治疗，因此了解MM患者的免疫功能状态有利于改善患者预后，提高免疫治疗的有效性。肿瘤的发生与机体免疫逃避有关，CD4+CD25+调节性T(Tregs)细胞是一群具有免疫负调控功能的T细胞亚群，在维持对自身成分免疫耐受的同时，也可能阻止了机体对自体肿瘤细胞的免疫，导致肿瘤的免疫抑制及免疫逃逸〔1〕，而在人类外周血中具有强大免疫调节活性的细胞主要限于CD4+CD25highT细胞亚群。本研究分析MM患者不同阶段外周血CD4+CD25highCD127low/-Tregs细胞的比例变化，探讨其与MM发生、发展的关系。

1 材料与方法

1.1临床资料 2012年1月至2014年6月我院血液内科收治的30例MM患者，诊断均符合中国诊断标准〔2〕。其中男20例，女10例，年龄56～78岁，中位年龄66岁。免疫球蛋白免疫分型：IgG 型11例、IgA 型14例、IgD 型1例、轻链型4例。其中初诊患者8例，复发22例。接受含硼替佐米方案联合化疗者17例，不含硼替佐米方案联合化疗者7例，未治疗6例。含硼替佐米化疗方案包括硼替佐米、地塞米松、阿霉素、环磷酰胺，即PAD、BCD、BD。不含硼替佐米化疗方案包括美法仑(马法兰)、泼尼松、沙利度胺、地塞米松、环磷酰胺、依托泊苷、顺铂，即MPT、TD、DCEP。MM 临床分期按国际分期系统(ISS)分期〔3〕对确诊患者评估，Ⅰ期：β2-微球蛋白(MG)<3.5 mg/L，血清白蛋白(Alb)≥3.5 g/dl；Ⅱ期：3.5 mg/L≤β2-MG<5.5 mg/L,Alb≥3.5 g/dl；Ⅲ期：β2-MG≥5.5 mg/L 。其中Ⅱ 期12例、Ⅲ 期18例。另取我院体检中心健康体检者年龄匹配的健康对照20例，男12例，女8例，年龄51～79岁，中位年龄65岁。均无肿瘤及自身免疫性疾病史。

1.2主要试剂和仪器 CD4-F1TC，CD25-PE，CD127-CY5，CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5抗体，OptiLyseC血细胞溶血剂，EPICS XL流式细胞仪为美国贝克曼-库尔特公司产品。

1.3样本的采集 均于清晨空腹抽取静脉血2～4 ml，置于EDTA抗凝管中备用。化疗病人于化疗前1天和第3个疗程化疗(完成2个疗程化疗)前1天抽血，方法同上。

1.4细胞染色 (1)取外周血100 μl，置于流式检测管中，分别加入不同荧光标记的单克隆抗体CD4-FITC，CD25-PE，CD127-CY5抗体各20 μl，充分混匀，室温避光孵育15 min。(2)各管加入500 μl溶血剂，混匀，避光10 min，加入适量PBS，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加500 μl PBS，用流式细胞仪检测。

1.5流式细胞仪(FCM)分析 采用EPICS XL FCM进行检测，结果分析应用EXPO32ADCXL4 Color软件，在FSC-SSC散点图上选定淋巴细胞群，以CD4设门，分析CD4+细胞上CD25和CD127表达，将CD4+CD25+细胞群平均荧光强度2倍的亚型细胞群定义为CD4+CD25highT细胞，分析CD4+T细胞上CD25highCD127low/-T 细胞的表达，计算CD4+CD25highCD127low/-T细胞的百分比。

1.6统计学处理 采用SPSS21.0统计软件进行t检验和方差分析及q检验。

2 结 果

2.1两组外周血CD4+CD25highCD127low/-T细胞水平比较 MM组CD4+CD25highCD127low/-Tregs细胞占CD4+细胞的百分比〔(4.06±1.03)%〕较健康对照组〔(1.38±0.54)%〕有显著升高(P<0.01)。

2.2外周血CD4+CD25highCD127low/-Treg 细胞在不同分期MM患者的比较 MM组Ⅱ和Ⅲ期CD4+CD25highCD127low/-Treg细胞水平〔(2.47±0.69)%，(5.12 ±1.52)%〕均高于健康对照组(P<0.05)。Ⅲ期明显高于Ⅱ期(P<0.05)。

2.3外周血CD4+CD25highCD127low/-Treg细胞在MM患者化疗前后的比较 MM组含硼替佐米亚组化疗后CD4+CD25highCD127low/-Tregs细胞数量〔(1.07±0.69)%〕较化疗前〔(4.41±1.17)%〕明显下降(P<0.01)。不含硼替佐米组化疗后〔(2.34±0.45)%〕较化疗前〔(4.05±1.02)%〕显著下降(P<0.05)。两组化疗前无显著差异，化疗后差异明显(P<0.05)。

3 讨 论

MM约占血液系统恶性肿瘤的10%，是一种浆细胞异常增生的恶性肿瘤，骨髓瘤细胞起源于B记忆细胞或幼浆细胞。在肿瘤免疫中，细胞免疫发挥着十分重要的作用，T细胞亚群对机体的免疫应答调控和维持免疫稳定具有重要作用，其中CD4+T细胞是辅助T细胞，在免疫应答中是主要反应细胞。而CD4+CD25+Tregs是近年发现的CD4+T细胞中一种具有免疫抑制功能的细胞。

Sakaguchi等〔4〕发现在正常人和小鼠外周血及脾脏组织的CD4+T细胞中有一亚群持续高表达CD25分子(IL-2受体a链)的亚群，该群细胞是一类重要的免疫调节细胞，将其命名为CD4+CD25+Treg。它具有免疫无能性和免疫抑制性两大特征〔5〕。CD4+CD25+Tregs是目前研究最多的Tregs群体，占人外周血CD4+T细胞总数的5%～10%〔6〕，其表面表达CD25、细胞毒T淋巴细胞相关抗原(CTLA)-4、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)和叉头样转录因子Foxp3等分子。目前有大量研究报道在众多肿瘤患者的外周血中CD4+CD25+Tregs细胞增多〔7〕。因此，肿瘤患者细胞免疫功能削弱的机制之一，可能是由于CD4+CD25+Tregs比例增加。在人类，CD25的表达是连续的，即有低、中、高之分，但具有免疫抑制功能的调节性T细胞主要集中在高表达CD25的CD4+T细胞(即CD4+CD25highT细胞)中。

Hori等〔8〕发现，CD4+CD25+Treg能够表达一种独特的转录抑制因子Foxp3，Foxp3的表达是Treg特异的〔9〕，是CD4+CD25+Treg区别于活化T细胞的一个特异性标志。近期有研究结果表明〔10〕，调节性T 淋巴细胞下调表达CD127分子(IL-7受体)。Liu等〔11〕认为CD127(IL-7受体)也可以作为Treg的特异性标志。Foxp3对CD127的启动子有抑制作用，因而Treg的CD127呈低表达。Foxp3高表达和CD127低表达之间存在良好的相关性，高表达Foxp3的Treg呈CD127低表达，以CD4、CD25及CD127为分子标志分离获得的Treg纯度远高于以其他分子标志分离获得的Treg。因此CD4+CD25highCD127low/-细胞群体更准确地反映了此Tregs群体，并且对于识别人类外周血CD4+CD25+Tregs更具有优势〔12〕。

本研究采用CD4+CD25highCD127low/-T 细胞定义MM患者中的Tregs细胞，体现了CD4+CD25+T 细胞的典型特征，发挥其膜表面标志的特征及特异性，通过CD127的表达来有效地区分效应T细胞和Tregs细胞。本研究提示MM患者Tregs异常增高和肿瘤负荷相关，反映了恶性骨髓瘤细胞可能通过诱导Tregs的免疫抑制作用逃脱免疫监视。这可能是MM患者免疫功能下降、免疫逃逸的重要机制。与大部分其他癌症患者的检验结果相一致，Beyer等〔13〕认为Treg细胞数量升高导致MM患者免疫力低下可能的原因是，Treg细胞通过分泌抑制性细胞因子，如IL-10、转化生长因子(TGF)-β及与其他细胞的间接接触等途径，抑制了效应性T细胞的活化增殖，从而达到抑制机体抗肿瘤的免疫反应。Prabhala等〔14〕提出Treg细胞的功能受损可能是通过IL-6途径引起的。由于CD4+CD25+T细胞是一种Treg细胞，在维持自身免疫耐受方面发挥着重要作用，所以它在人类肿瘤中的价值也受到重视，充分发挥Treg细胞的免疫调节作用，有可能改善MM患者的免疫状态，提高机体免疫力，为肿瘤免疫治疗提供参考。细胞免疫功能异常可能在MM发病机制中起着重要作用。Treg细胞水平的增高与疾病的严重程度呈正相关，可反映MM 的恶性程度，并可作为检测MM疾病进展及判断预后的辅助指标。本文表明化疗对Tregs比例有影响，提示化疗后患者免疫功能有所恢复，可能对患者体内Tregs的变化起着重要作用。化疗药物如环磷酰胺、沙利度胺、雷利度胺等已被证实具有清除MM患者Treg细胞的作用〔15〕。硼替佐米可通过抑制核因子(NF)-κB通路抑制T细胞增殖、活化，应用硼替佐米治疗移植物抗宿主病(GVHD)的实验证实该药对人体外周血Treg细胞有清除作用〔16〕。

综上，目前大剂量化疗联合造血干细胞移植的微小残留病状态下，适当地去除MM患者体内Tregs或阻断其活性，而又不致于诱发自身免疫病的发生，可能会提高免疫治疗的有效性，为肿瘤的免疫治疗提供一条新途径，有望成为根治MM的方法之一。

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