超声治疗提高前列腺癌患者免疫功能的研究进展

张 蔚，白文坤，申 锷，胡 兵

（上海交通大学附属第六人民医院超声医学科 上海超声医学研究所，上海 200233）

前列腺癌是男性泌尿系统最常见的肿瘤之一，多发于老年男性，在欧美发达国家中发病率位居第一，死亡率位居第二[1]。近年来，我国前列腺癌的发病率存在上升趋势。手术切除局部病灶并辅以放疗及激素疗法是现行治疗早期前列腺癌的标准方法，但有近15%～40%患者接受根治性切除术后8 年出现复发，约1/3 患者会发生远处转移，平均生存期小于5 年。

目前，离体和在体实验均表明，超声可杀灭肿瘤细胞，破坏肿瘤组织并抑制其增殖。它的作用机制主要为热效应和空化效应。许多研究结果表明，超声治疗能够诱发机体的免疫反应，识别并清除肿瘤细胞。这对杀灭残留癌细胞，尤其是复发或转移后的激素抵抗性前列腺癌将起到进一步的作用。阐明超声治疗前列腺癌与免疫反应的关系，将极大的提高超声治疗的应用价值。

1 前列腺癌患者的免疫

1.1 树突状细胞（DC）

前列腺癌免疫微环境研究最为深入的是DC。它是体内功能最强的抗原呈递细胞（APC）。DC 在抗肿瘤免疫中先趋向于肿瘤组织周围，再逐渐移入肿瘤细胞之间，通过其树突与肿瘤细胞密切接触，摄取肿瘤抗原，然后迁移至局部淋巴结，将抗原呈递给T 细胞，通过刺激、致敏T 淋巴细胞，产生细胞毒性T 淋巴细胞（CTLs），后者杀伤破坏肿瘤细胞，启动机体免疫应答，形成免疫监视[2]。

Troy 等[3]以CD45+和CD1a+作为DC 标志，通过免疫组化的方法分析研究前列腺癌组织和癌周正常组织DC 数目变化，结果显示正常组织DC 总数较癌组织多，而巨噬细胞、B细胞等其他APC 在两种组织中无明显差异，从而说明了DC数目的减少在前列腺癌免疫逃逸中的特殊作用。Aalamian 等[4]用健康志愿者的外周血单核细胞作为DC 细胞前体，实验组与对照组分别加入前列腺癌细胞系LNCaP 和凝集素，培养后离心涂片观察，发现对照组细胞呈现典型的DC 形态学特征，树突完整、细胞核不规则、细胞体积较大，而实验组细胞没有这些特征。进一步说明前列腺癌细胞不仅可以引起DC 的凋亡，也会显著地抑制DC 的再生和分化。肿瘤微环境中这种DC 数量与活性的改变会极大削弱特异性免疫反应的初始进程[5]。

1.2 T 淋巴细胞亚群与NK 细胞亚群

细胞免疫是肿瘤免疫的主力，T 淋巴细胞和NK 细胞为细胞免疫的主要效应细胞。T 淋巴细胞主要发挥免疫监视及抗肿瘤免疫作用，NK 细胞则无需肿瘤特异性抗原识别，可以直接杀伤肿瘤细胞。古炽明等[6]取前列腺癌患者的外周血，用流式细胞仪检测T 淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+、及CD8+）及NK 细胞（CD(16+56)+）水平，发现上述标志分子均显著低于（P<0.01）或明显低于（P<0.05）对照组，且CD4+/CD8+比例失衡，提示前列腺癌患者的细胞免疫功能紊乱或下降。

2 超声治疗肿瘤的免疫机制

2.1 热效应与免疫

肿瘤细胞致死温度临界点在42.5℃～43℃，正常细胞则为45℃。低强度聚焦超声在直径3 cm 聚焦范围内持续20～30 min 产能<100 W/cm2，靶区温度达临界点，具有温热杀伤效应但不破坏肿瘤组织；高强度聚焦超声在直径0.5～1.0 cm聚焦范围内持续5～10 s 产能100～1 000 W/cm2甚至更高，靶区温度可高达100℃，可直接破坏肿瘤组织，减轻机体肿瘤负荷，打破免疫系统与肿瘤之间的动态平衡，从而激发免疫系统的抗肿瘤效应。

超声聚焦所引起的热效应会引起细胞内各种免疫调节蛋白变性。功能受损的细胞释放的各种“危险信号”分子会警示免疫系统，坏死的细胞将内容物释放到胞外并触发免疫反应[7]。合成的热休克蛋白（HSP）可以刺激DC 细胞分化成熟，同时将精氨酸抗原协同呈递给抗原特异性T 细胞，诱导细胞免疫初始化[8]。Wu 等[9]研究发现乳腺癌细胞经高强度聚焦超声（HIFU）治疗后细胞膜表面HSP-70 表达上调，主要集中在中央坏死区，周缘仅有少量可见。而前列腺癌细胞经超声治疗后HSP 的表达是否有所改变，对免疫功能是否会产生影响，这些问题都有待进一步探究。

2.2 空化效应与免疫

空化作用为液体中存在的微小气泡，即空化核，在声波作用下产生震荡、膨胀、萎陷至爆裂等一系列动力学过程，并迅速释放能量使组织及细胞结构产生机械性破坏。通常生物体内内源性空化核不丰富，故空化阈高，通过引入外源性空化核——微泡，可以增加空化核密度，降低空化阈[10]。空化效应可引起肿瘤细胞坏死、凋亡、细胞膜通透性增高以及细胞表达的相关蛋白水平变化等生物学效应，对肿瘤组织的直接破坏作用同样能使肿瘤/宿主优势得以改善，激发机体免疫系统的抗肿瘤效应。

根据对经压力波作用后细胞的观察，发现压力波一方面可增加膜脂流动性，使镶嵌在脂质双层中的肿瘤抗原暴露增加；另一方面对膜结构的机械性破坏使存在于胞浆和细胞核内的肿瘤抗原暴露增加，从而改变了肿瘤组织的免疫原性，加强了机体对肿瘤组织的免疫反应。

超声的空化效应对前列腺癌患者的免疫作用也可通过血管毁损的间接作用来实现。齐士勇等[11]认为前列腺癌细胞通过分泌血管内皮生长因子（VEGF）、IL-10 等抑制了DC 的生成及活化，并诱导DC 凋亡，使其功能下降，削弱了机体的免疫监视作用，形成了前列腺癌的免疫逃逸。Wang 等[12]将前列腺癌细胞系DU145 种植到裸鼠皮下，研究低频超声辐照微泡对前列腺癌移植瘤的影响。将40 只裸鼠随机分为空白对照组、单独超声组、单独微泡组和超声微泡组。实验后发现超声微泡组的平均肿瘤体积显著小于其他治疗组（P<0.05），免疫组化可见肿瘤细胞损伤，电镜下可见血管内皮受损，微血管密度和平均VEGF 含量显著低于其他治疗组（P<0.05）。由此可推论低频超声辐照微泡可抑制前列腺癌移植瘤的生长，而这种作用很有可能是通过空化效应引起微血管损伤实现的。超声的空化效应能否通过影响VEGF 的表达进而调节DC 细胞介导的免疫功能，尚有待进一步研究论证。

3 超声治疗前列腺癌诱发机体免疫反应

3.1 低频超声辐照微泡治疗前列腺癌的免疫反应

低频超声通常是指频率在20 kHz～1 MHz 之间的超声波，热量和升温均接近于可以忽略的程度，其产生的生物学效应主要与空化作用有关[13]。人工引入微泡对比剂，提高空化核密度，可使在达到同样效果的情况下所需的超声能量降低，减少对正常组织的损伤，提高超声使用的安全性。

近年来很多研究都证实低频超声辐照微泡可以在瞬间小范围破坏细胞膜完整性，促进靶向药物的胞内转运和基因转染，即所谓“声孔效应”[14]。这一发现为细胞免疫和基因治疗提供了新思路。Olga 等[15]利用“声孔效应”将IL-27 基因转染至三种免疫耐受的前列腺癌细胞内，对肿瘤生长、基因组表达和多种细胞因子进行了系统分析，结果证实该方法可以有效抑制肿瘤生长、提高免疫机能。Garrett 等[16]也进行了相关研究，将编码GM-CSF 和B7-1 共刺激分子的DNA 片段导入小鼠肿瘤细胞，并对辐照条件进行了优化，发现治疗效果堪比电穿孔，低频超声辐照微泡作为无创无病毒基因干扰的新方法是有效、精确且安全的。

3.2 HIFU 治疗前列腺癌的免疫反应

近年来，HIFU 成为局限性良恶性实体肿瘤的无创治疗新方法，具有广阔应用前景[17]。大量的动物实验和临床研究证实，HIFU 治疗对早期局限性肿瘤和放、化疗失败需要补救性治疗的恶性肿瘤效果显著。

早期Yang 等[18]证实HIFU 治疗小鼠成神经细胞瘤和人晚期实体肿瘤都可以触发抗肿瘤免疫反应。随后Hu 等[19]发现热HIFU 和机械HIFU 治疗小鼠结肠癌移植瘤后，可分别将脱水淋巴结中的CFSE 染色阳性DC 细胞数提高5 倍和10倍；可将CD11c+细胞数目提高3.1 倍和4 倍，而DC 细胞注射则仅提高1.5 倍；进一步免疫分析证实CTL 活性增高，IFN-γ 分泌细胞数增多。Huang 等[20]在此基础上进一步研究，发现HIFU 通过抑制STAT3（signal transducer and activator of transcription 3）的活性，来增强前列腺癌移植瘤的免疫状态。STAT3 被免疫抑制因子如IL-10 激活，而激活的STAT3可以抑制促炎细胞因子如IL-12 的表达[21]，因此在肿瘤的发生和免疫耐受中具有重要作用。接种前列腺癌细胞的小鼠分别行HIFU+手术与单纯手术组治疗后，虽然都没有肿瘤复发和远处转移，但前者能够显著抑制再接种肿瘤的生长，同时下调STAT3 的活性、增加脾中CTL 细胞和肿瘤引流淋巴结数目，改善宿主生存率。并发现HIFU+手术相比于单纯手术可以显著降低免疫抑制水平，增加DC 细胞数目和活性。

然而，也有部分研究小组发现HIFU 消融后肿瘤抗原表达会下调，这也就意味着肿瘤组织更易逃脱免疫系统的监视，利于癌细胞的转移复发[22]。HIFU 治疗对抗肿瘤T 细胞免疫反应究竟会产生怎样的影响，目前尚无定论。

4 问题与展望

超声治疗是一种非侵入性的治疗方法，将超声波的能量作用于靶组织，产生一系列物理化学效应使肿瘤部位坏死纤维化，达到无创伤、无电离辐射的治疗恶性肿瘤的目的，是对传统外科手术和放射治疗的良好补充，近年来受到广泛关注。前列腺癌细胞产生各种细胞因子抑制多种免疫细胞，尤其是树突状细胞的成熟和活化，削弱免疫系统对肿瘤细胞的监视，使患者免疫功能紊乱，抵抗力下降，易发生前列腺癌转移和复发。利用超声产生的肿瘤损伤，在抑制肿瘤生长的同时诱发机体免疫应答，对原发灶及转移灶发挥免疫杀伤，从而抑制肿瘤发生发展，对于晚期和激素不敏感型前列腺癌的治疗具有重要临床意义。这一课题虽有一定理论基础和初步探索性实验成果，但若应用于临床实践还需进行系统完善的研究论证。总体来说，超声治疗及应用还有广阔的发展前景。

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