关于乌鸡白凤丸测定芍药苷含量提取方法的对比研究

王 蕾 范书峤 樊明喜

（南京生命能科技开发有限公司·210016）

乌鸡白凤丸由乌鸡、当归、地黄、白芍等20味中药制成，为《中国药典》2010年版收载品种，具有补气养血、调经止带之功效，用于治疗气血两亏引起的月经不调、行经腹痛、崩漏带下、产后虚弱等症。其中白芍是组方中的主要药物之一。研究表明，乌鸡白凤丸可降低大鼠甘油三脂及氧化低密度脂蛋白、阻止动脉硬化[1-2]，有防治骨质疏松[3]，保护肝脏[4]等作用，对阿尔茨海默病具有潜在的药用价值[5]。因此，乌鸡白凤丸的临床应用越来越广，目前国内有多家药厂生产。2010年版药典已有乌鸡白凤丸含量测定的质量标准，也有文献报道乌鸡白凤丸中丹参酮、丹参素和芍药苷含量测定的方法[6-8]。但至今未有对药典的芍药苷含量测定中样品提取方法进行比较研究。鉴于药典方法含量测定项中芍药苷的测定步骤操作较复杂，实验周期较长且平行样品测定结果偏差较大问题，本文以乌鸡白凤丸中白芍的主要成份芍药苷含量为指标，采用2010版中国药典的色谱条件，通过含量结果比较评价不同提取方法对结果的影响，为简化乌鸡白凤丸中芍药苷含量测定的提取操作步骤，缩短生产过程中对该含量测定的实验周期提供实验依据。

1 仪器与试药

安捷伦Agilent1200系列液相色谱仪，UV-260岛津紫外分光光度仪；芍药苷对照品由中国药品生物制品检定所提供，批号110736-200934；乌鸡白凤丸：为南京同仁堂药业有限责任公司生产大蜜丸。

2 方法与结果

2.1 色谱分析条件

AgilentZorbax SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm)Serial No.：USCL029483;依利特Sinochrom OODSBP-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm， 5μm)，Serial No.：E2018436;流动相甲醇-水(33：67)，检测波长230 nm，理论板数按照芍药苷峰计应不小于2000;流速1.0ml·min-1，柱温为25℃，进样量10μl;环境条件：所有试药均为分析纯；HPLC所用试液为色谱纯；水均为纯化水。室温为20℃，相对湿度为55.0%。

2.2 供试品溶液配制

供试品溶液的制备方法（超声处理参数为功率300W，频率50k Hz）

2.2.1 药典方法 取本品，研细，精密称取5.0 g，精密加入30%乙醇25 ml，称重，时时振摇，静置24 h，超声处理30 min，放冷，再称定重量，加30%乙醇补足减失质量，滤过，精密量取续滤液5 ml，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5 cm，长12 cm)，用30%乙醇100 ml洗脱，收集洗脱液，置蒸发皿中蒸干，残渣用水5ml分次使溶解，转移至25mL量瓶中，容器用甲醇适量多次洗涤，洗液并入同一量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，既得。

2.2.2 提取方法1 取本品，研细，精密称取5.0g，精密加入30%乙醇25 ml，称重，时时振摇，放置24 h，超声处理30 min，放冷，称重，用30%乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 ml，置蒸发皿中蒸干，以下同药典方法。

2.2.3 提取方法2 取本品，研细，精密称取5.0g，精密加入30%乙醇25 ml，称定重量，超声处理30min，放冷，称重，用30%乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 ml，置蒸发皿中蒸干，以下同药典方法。

2.2.4 提取方法3 取本品，研细，精密称取5.0g，精密加入30%乙醇25 ml，称定重量，超声处理30min，放冷，称重，用30%乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 ml转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度定容，摇匀，既得。

2.3 样品含量测定

将样品按2.2方法制备供试品溶液，按2.1色谱条件进行测定，以外标法计算芍药苷含量，结果见表1。

表1 样品中芍药苷含量(mg/丸)

2.4 不同提取方法色谱分离结果见表2

表2 不同提取方法色谱分离结果汇总表

3 方法学验证

通过2.4对不同提取方法对含量测定结果影响的总结，认为提取方法2和提取方法1虽然测定结果大小有差异，但色谱分离情况看基本无影响，且提取方法2的含量测定结果接近药典方法的测定结果，因此选择提取方法2进行提取方法对含量测定影响的验证。

3.1 标准曲线与线性范围

精密称取五氧化二磷干燥24 h的芍药苷对照品适量，加甲醇制成42.16ug·ml-1的对照品溶液。精密吸取对照品液(42.16 ug·ml-1)2， 5， 10，15， 20μL，按上述色谱条件测定峰面积，以进样量x(μg)对峰面积Y进行线性回归，得回归方程y=0.775x-0.3302，r=0.9999。表明芍药苷在84.32～843.2μg呈良好的线性关系。

3.2 精密度试验

取同一供试品溶液，连续进样7次，结果RSD 0.28% (n=7)，表明仪器精密度良好。

3.3 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0，2， 4， 6， 8， 12，18， 24 ，48h进样，测得峰面积，计算得峰面积的RSD 为1.0%。表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

3.4 重复性试验

取同一批号(101201)样品7份，分别依本法处理进行测定，结果芍药苷平均含量为4.09mg/丸，RSD 0.6% (n=7)，结果表明以本法测定重复性好。

3.5 回收率试验

精密称取已测知含量的样品(101201)约2.5 g，共9份，分别准确加入一定量的芍药苷对照品溶液，依上述方法进行含量测定并计算回收率，结果见表3。方法平均回收率为99.4%，RSD0.8% (n=9)，符合中药制剂分析要求。

表3 芍药苷加样回收率

3.6 结论

经方法学验证，该提取方法的样品平均回收率99.4%，回收率试验的RSD为0.8%（n=9）；重复性实验RSD为0.6%，表明该法准确可靠、重现性好，可作为制剂中芍药苷含量测定的质量控制标准。

4 讨论

（1）从各提取方法的测定结果可以看到平行样品的测定结果偏差，不经过树脂柱处理的样品明显具有更好的平行性。

（2）本文采用的样品选择的是大蜜丸，主要是因为大蜜丸中含糖量高，提取方法是否能有效排除糖、蜜对测定结果影响最大。故本文在简化药典提取方法的操作步骤的同时，也对每一个简化环节进行了有效的对比研究，结果表明：通过D101型大孔树脂柱确实可以有效的去除杂质，但在芍药苷检出位置是否通过树脂柱的影响并不大；通过软化浸泡过夜24小时后超声提取，与直接超声提取，从含量测定结果看区别不明显，因此本简化方法可以用于生产环节中间体的质量控制，可以缩短检验周期，从而缩短生产周期。

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