2012年重庆单中心腹泻患儿感染诺如病毒及其基因型别和重组的研究

唐 香 陈茹娟 赖方方 黄爱龙 许红梅

·论著·

2012年重庆单中心腹泻患儿感染诺如病毒及其基因型别和重组的研究

唐 香1陈茹娟1赖方方1黄爱龙2许红梅3

目的 了解重庆地区门诊腹泻患儿感染诺如病毒(NV)流行株的变迁及基因重组情况。方法 采集2012年1～12月就诊于重庆医科大学附属儿童医院的疑似病毒性腹泻患儿的粪便标本。采用JVl2/JVl3、GⅠ SKF /GⅠ SKR(COG2F/GⅡ SKR)两对引物，对NV基因组的部分RNA依赖的RNA聚合酶区和衣壳蛋白的N/S区分别进行RT-PCR核酸检测，所有阳性产物进行回收纯化、测序，用DNAstar和MEGA 5.05软件对序列分别进行比对和构建进化树。并将疑似重组株的标本再用JVl2/GⅠ SKR(JVl2/GⅡ SKR)进行PCR扩增，用SimPlot软件对序列进行重组鉴定。结果 384例腹泻患儿粪便标本进入本文分析，男248例，女136例，年龄(13.1±14.4)个月。①NV阳性84/384例(21.9%)，<60月龄组NV阳性构成比为96.4%(81/84)。NV在6、8和9月份检出率较高，3和4月份检出率最低。②84例NV阳性标本capsid的N/S区基因片段测序显示，GⅡ.4 2006b型37例，GⅡ.4 New Orleans 2009型1例，GⅡ.4 Sydney 2012型27例，GⅡ.3型12例，GⅡ.6型3例， GⅡ.13型3例，GⅡ.5型1 例；1～7月份 GⅡ.4 2006b型为主要流行株，8～12月GⅡ.4 Sydney 2012型为主要流行株；③共检出44株重组株，分别是GⅡ.e/GⅡ.4 Sydney 2012型27株、GⅡ.7/GⅡ.6型1株、GⅡ.22/GⅡ.5型1株、GⅡ.12/GⅡ.3型12株，GⅡ.16/GⅡ.13型3株。结论 重庆地区NV重组现象非常明显，2012年8～12月NV优势株逐渐由GⅡ.4 2006b型转为GⅡ.e/GⅡ.4 Sydney 2012型的重组株，并检出GⅡ.22/GⅡ.5型和GⅡ.16/GⅡ.13型2种新型重组株。

诺如病毒； 基因分型； 重组； 进化分析

诺如病毒(NV)在急性非细菌性腹泻中有非常重要的地位，仅次于轮状病毒[1]。人群对NV普遍易感，该病毒在外界环境中生存能力强，小剂量病毒(<100个病毒颗粒)即可引起感染，极易引起暴发，成为难以控制的胃肠炎[2]。NV属于杯状病毒科诺如病毒属，全长7.3～7.7 kb，有3个开放阅读框(ORFs)。NV主要分为5个基因组(GⅠ、GⅡ、GⅢ、GⅣ和GⅤ)，研究表明GⅠ、GⅡ和GⅣ可以感染人类，而最常见的为GⅠ和GⅡ。目前，根据NV次要结构蛋白VP1的基因序列特征可将GⅠ和GⅡ分别分为8和21个亚型；若根据RNA聚合酶(RdRp)部分基因序列特征，可将GⅠ和GⅡ分别分为14和31个亚型[3,4]。NV易发生遗传重组， NV重组株于1999年由Jiang等[5]首次发现并鉴定，随后在世界各地由NV引起暴发和散发的急性胃肠炎病例中，均有NV重组株被检出，但国内NV的研究多关注于其分子流行病学，对NV重组的研究较少[6]。本研究通过对2012年重庆单中心病毒性腹泻患儿感染NV情况行全年监测，了解本地区NV的流行状况、流行株的变迁和NV重组株的检出情况，为NV的流行防控提供依据。

1 方法

1.1 纳入标准 ①每日排便≥3次的腹泻患儿；②粪便形状呈稀便，蛋花样便，水样便，排除黏液便或脓血便；③腹泻持续时间<2周；④粪便常规镜检WBC<10·HP-1。

1.2 伦理 本研究获得了重庆医科大学附属儿童医院(我院)伦理委员会批准。

1.3 标本来源 本文为研究生课题，由本文第一作者于2012年1～12月每周二和周六上午在我院门诊临床检验中心收集符合条件的全部粪便标本，同时询问患儿的基本信息、每日排便次数、粪便性状和腹泻持续时间。

1.4 NV(GⅠ和GⅡ)RT-PCR检测和序列分析 病毒RNA的提取采用德国QIAGEN公司病毒核酸提取试剂盒(货号57704)，逆转录采用美国Invitrogen公司RNA逆转录试剂盒(货号18080-044)，操作均按试剂盒说明书进行；用JVl2/JVl3、GⅠ SKF/GⅠ SKR(COG2F/GⅡ SKR)两对引物对NV(GⅠ和GⅡ)基因组RdRp和衣壳蛋白(capsid)区域分别进行PCR核酸检测，PCR所用的ExTaq DNA聚合酶购自宝生物工程(大连)有限公司，PCR所用引物序列及反应条件见参考文献[7,8]；用1.5%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定；对所有阳性标本进行胶回收、纯化后送上海英俊公司测序；采用DNAstar软件对测序结果进行编辑，编辑好的序列进行BLAST比对，并用NV基因分型工具(http://www.rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool/)再次确定是否为目标序列[3]。使用MEGA 5.05 软件构建进化树，Kimura's two-parameter 法计算遗传距离，邻接法(Neighbor-joining)bootstrap重复检验1 000次。

1.5 NV重组分析 系统进化树分析后，不在同一分支的[即在RdRp区和capsid的N/S区基因型别不同]可能为重组病毒，之后将重组株的标本再用JVl2/GⅠ SKR(JVl2/GⅡ SKR)进行PCR扩增，引物序列及PCR条件见参考文献[9]。并用SimPlot 3.5.1软件对序列进行重组分析鉴定。

1.6 NV流行特征分析 对NV的流行特征采用传统的按月份和年龄的分析方法，其中<24月龄患儿以每6个月作为一个时间段[10,11]，之后分为～60和>60月龄。

2 结果

2.1 一般情况 384例腹泻患儿粪便标本进入分析，男248例，女136例，年龄1～121个月，平均年龄(13.1±14.4)个月。

2.2 NV的流行特点 384例粪便标本中，NV阳性84例(21.9%)，其中男57例(67.9%)，女27例；男女差异无统计学意义(χ2=0.504，P>0.05)。0～6、～12、～18、～24、～60和>60月龄患儿NV阳性率分别为18.8%(19/101)、27.0%(48/178)、13.0%(6/46)、5.3%(1/19)、20.6%(7/34)和50.0%(3/6)。

图1显示，NV全年可见散发，2012年1～12月各个月份均有检出。6、8和9月份检出率较高(33.3%～50.0%)，3和4月份检出率最低。

2.3 NV基因分型情况

2.3.1 RdRp区基因片段的测序和分析 84份NV阳性粪便标本在327 bp处出现特异性条带( 图2A)， 经过样品回收测序，与GenBank下载的参考序列一起构建系统进化树，核酸序列比对可将其分为8种基因亚型。分别是GⅡ.4 2006b型37例，GⅡ.4 New Orleans 2009型1例， GⅡ.e型27例，GⅡ.12型12例，GⅡ.16型3例，GⅡ.6型2例，GⅡ.7型1例，GⅡ.22型1例。每种基因型的代表序列如图3A所示。

图1 2012年重庆单中心NV感染患儿月份分布

Fig 1 Monthly distribution of NV in 2012,Chongqing

2.3.2 Capsid的N/S区基因片段的测序和分析 84份NV阳性粪便标本在387 bp处出现特异性条带(图2B)，经过样品回收测序，与GenBank下载的参考序列一起构建系统进化树，核酸序列比对可将其分为7种基因亚型。分别是GⅡ.4 2006b型37例，GⅡ.4 New Orleans 2009型1例， GⅡ.4 Sydney 2012型27例，GⅡ.3型12例，GⅡ.6型3例， GⅡ.13型3例，GⅡ.5型1 例(图3B)。

图2 PCR产物电泳图

Fig 2 Electrophoresis map of PCR products

Notes A: product of NV(327 bp) of RdRp region; B:product of NV (387 bp) of capsid N/S region. M: marker; Lane 1,2 ,3 represented the NV positive diarrhea specimens

图3 2012年重庆单中心NV系统进化树分析

Fig 3 The phylogenetic tree of NV strains in Chongqing, 2012

Notes A: partial RdRp region of NV; B: partial capsid N/S region of NV.The recombinants identified in figure 4 were denoted by colored boxes

各月份检出GⅡ.4型的分布如图4所示，1～7月份 GⅡ.4 2006b型为主要流行株，8～12月GⅡ.4 Sydney 2012型为主要流行株，GⅡ.4 New Orleans 2009型仅在11月份检出1株。

2.4 NV重组情况 2个不同区域分型结果不一致的病毒株为疑似重组病毒株。共检测出44株疑似重组株，分别是GⅡ.e/GⅡ.4 Sydney 2012型27株、GⅡ.7/GⅡ.6型1株、GⅡ.22/GⅡ.5型1株、GⅡ.12/GⅡ.3型12株，GⅡ.16/GⅡ.13型3株。为进一步确定是否存在这5种重组类型，在上述5种类型疑似重组株中任意选择3、1、1、4和3株再用JVl2/GⅡ SKR进行PCR扩增，其扩增的序列长度1 111 bp(图5)，包含上述分型所扩增的RdRp区和capsid的N/S区，经SimPlot 3.5.1软件对序列进行重组鉴定显示，本研究共检测到5种ORF1/ORF2重组基因型(图6)。

图4 2012年重庆单中心儿童感染NV GⅡ.4型(capsid的N/S区)的月份分布

Fig 4 Monthly distribution of Norovirus GⅡ.4 genetypes(capsid region)in Chongqing, 2012

图5 PCR产物电泳图

Fig 5 Electrophoresis map of PCR products (1 111 bp)

Notes M: marker; Lane 1,2 ,3 represented the NV positive diarrhea specimens

3 讨论

本研究对2012年重庆单中心384例急性病毒性腹泻患儿行NV检测，检出率为21.9%，提示NV已是重庆地区病毒性腹泻的重要病原之一。重庆(2009年)、成都(2006至2008年)、南京(2009至2010年)[7,8,12]等研究发现NV患儿的发病年龄集中在7～12月龄，本研究亦显示7～12月龄急性病毒性腹泻患儿的NV阳性率最高，与上述文献报道的结果一致，考虑与7～12月龄患儿来自母亲的获得性抗体逐渐消失有关。

NV感染高发季节在不同地区有所不同，受气温、湿度、人群免疫力和新变异株出现时间等条件的影响。中国台湾[13]通过监测2007、2010和2011年的NV流行特征，显示5、6、11和12月份为NV的高发季节；武汉[14]2007至2010年成人NV流行高峰为11月至次年2月份，但儿童NV流行无明显的季节特点。本研究显示，2012年重庆地区NV检出率较高的月份是6、8和9月份，但考虑到病例数较少，有待进一步分析NV感染的高发季节。

目前，全球对NV的分型主要针对ORF2基因的N/S区[15]，本研究通过扩增该区域，监测2012年重庆单中心急性病毒性腹泻患儿中NV的感染状况，发现NV呈现出丰富的遗传多样性，其中GⅡ.4型NV为主要流行基因型(77.4%，65/84)。GⅡ.4型NV自20世纪90年代中期成为全球主要流行株以来，间隔2～3年会出现新的变异株并引起新一轮的大规模流行，先后有 US95/96 (1995)， Farmington Hills (2002)， Hunter virus (2004)，Yerseke (2006a)，Minerva (2006b)，Apeldoorn (2008)和New Orleans (2009)等变异株被发现[16]。本研究显示，1～7月份GⅡ.4 2006b型为主要流行基因型，8～12月份 GⅡ.4 Sydney 2012型为主要流行株。GⅡ.4 Sydney 2012型NV于2012年3月在澳大利亚被首次报道[17]，其后在新西兰、日本、英国、加拿大、美国等国家以及中国上海、北京、浙江等地报道[17～19]，已逐渐成为全球主要优势流行株。然而，合适的体外复制体系和小动物培养模型的缺乏增加了人源NV研究的困难，目前还缺乏有效的病毒预防与治疗手段，因此，掌握NV主要优势株与变异株的流行特点将对病毒检测及疫苗开发具有重要意义。

NV属于无包膜单股正链RNA病毒，在复制过程中由于缺乏校正功能易发生突变，且常通过交换序列产生新的重组株[20]。1999年Jiang等[5]首先发现并鉴定了1例天然重组毒株NVArg 320，是Lordsdale/RdRp(GⅡ.4型)和MxV/capsid(GⅡ.3型)重组而成。中国首例重组株146/Kunming/04/China于2006年被鉴定，是由Saitama U4/RdRp(GⅡ.6型)和Ieeds/90/UK/capsid(GⅡ.7型)重组而来的[21]。之后，NV不同重组类型不断被发现，Bull等[22]总结了各国报道的20种重组类型，Yu等[23]报道了13种在中国检测到的NV重组类型。本研究共检测到5种ORF1/ORF2重组基因型，分别是GⅡ.e/GⅡ.4 Sydney 2012型、GⅡ.7/GⅡ.6型、GⅡ.22/GⅡ.5 型、GⅡ.12/GⅡ.3 型和GⅡ.16/GⅡ.13 型，其中GⅡ.7/GⅡ.6型和GⅡ.12/GⅡ.3型在上海、北京等地都有检出[4,23]，GⅡ.12/GⅡ.3型目前仅在中国、日本和韩国等地检测到[24]。总结以往对NV重组株的报道，流行株GⅡ.4型(capsid分型)少见于重组株[21]，而重庆单中心2012年8～12月占优势的NV即GⅡ.4型的重组株GⅡ.e/GⅡ.4 Sydney 2012型，浙江湖州也有GⅡ.e/GⅡ.4 Sydney 2012型的相关报道[25]。特别是GⅡ.22/GⅡ.5型和GⅡ.16/GⅡ.13型的重组类型为国内外首次报道，丰富了NV重组的研究资料。

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(本文编辑：丁俊杰)

The genotype and recombination of norovirus in children with diarrhea caused by viral infection in Chongqing, 2012

TANG Xiang1,CHEN Ru-juan1, LAI Fang-fang1, HUANG Ai-long2, XU Hong-mei3

(1 Ministry of Education Key Laboratory of Child Development and Disorders, Key Laboratory of Pediatrics in Chongqing,Chongqing International Science and Technology Cooperation Center for Child Development and Disorders; 2 Key Laboratory of Molecular Biology for Infectious Diseases,Ministry of Education,Chongqing Medical University；3 Department of Infectious Diseases, Children's Hosptital of Chongqing Medical University； Chongqing 400014, China)

XU Hong-mei，E-mail:xuhongmwpx@yahoo.com

ObjectiveTo investigate the genetic variation and recombination of norovirus(NV) in children with acute diarrhea in Chongqing.MethodsDiarrhea specimens in children with suspected viral diarrhea from January 2012 to December 2012 at the clinical laboratory center of the Affiliated Children's Hospital of Chongqing Medical University were collected. Two regions of NV genome(partial RdRp and capsid N/S region) were respectively amplified by primers of JVl2/JVl3 and GⅠ SKF /GⅠ SKR(COG2F/GⅡ SKR) using RT-PCR．All positive samples were purified and sequenced.The obtained sequences were aligned by DNAstar followed by phylogenetic analysis using MEGA 5.05 software. Some potential recombinant genomes of NV were amplified by PCR using primers JVl2/GⅠ SKR(JVl2/GⅡ SKR) when phylogenetic analysis indicated incongruent clustering for partial sequences of the RdRp and capsid genes in the same samples and recombination analysis was conducted using the SimPlot program.ResultsA total of 384 pediatric outpatients (248 males and 136 females) were enrolled in the present study, aged from <1 month to 121 months with a mean of (13.1 ± 14.4) months. ①84 of 384 stool specimens were detected as NV-positive(21.9%).The constituent ratio of NV was 96.4%(81/84)in children younger than 60 months.The isolation rates were higher in June, August and September, and the lower ones were in March and April. ②84 positive specimens were classified based on the capsid sequence:37 strains were GⅡ.4 2006b，1 was GⅡ.4 New Orleans 2009，27 were GⅡ.4 Sydney 2012，12 were GⅡ.3，3 were GⅡ.6，3 were GⅡ.13， and 1 was GⅡ.5. GⅡ.4 2006b was the predominant genotype from January to June,while GⅡ.4 Sydney 2012 was the predominant genotype from August to December.③Phylogenetic and Simplot analyses showed that 44 recombinant strains(RdRp/capsid) were detected: 27 were GⅡ.e/GⅡ.4 Sydney 2012 recombinants,1 wasGⅡ.7/GⅡ.6 recombinant, 1 was GⅡ.22/GⅡ.5 recombinant, 12 were GⅡ.12/GⅡ.3 recombinants, 3 were GⅡ.16/GⅡ.13 recombinants.ConclusionThe NV recombinant in Chongqing region was at common frequency,after August 2012, the NV predominant strains of GⅡ.4 2006 gradually shifted to the recombination strains of GⅡ.e/GⅡ.4 Sydney 2012,and this is the first report of the detection of GⅡ.22/GⅡ.5 and GⅡ.16/GⅡ.13 novel recombinant NV.

Norovirus; Genotype; Recombination; Phylogenetic analysis

“十二五”国家科技重大专项：2012ZX10004212-003

1 儿童发育疾病研究教育部重点实验室，儿科学重庆市重点实验室，重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地；2 重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室；3 重庆医科大学附属儿童医院感染科 重庆，410014

许红梅，E-mail:xuhongmwpx@yahoo.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2014.03.002

2014-04-20

2014-05-17)