组蛋白乙酰化修饰调控RAR-β2表达与宫颈病变的相关性*

伍娇娇 冯定庆 田 园 徐汉杰 李 兵 凌 斌

组蛋白乙酰化修饰调控RAR-β2表达与宫颈病变的相关性*

伍娇娇 冯定庆 田 园 徐汉杰 李 兵 凌 斌

目的：探讨组蛋白乙酰化修饰与RAR-β2表达及宫颈病变发生发展的关系。方法：收集正常宫颈、宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）Ⅱ～Ⅲ和宫颈鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）组织，分别采用免疫组织化学和Western Blot方法检测AcH3、RAR-β2和Involucrin的表达；分析组蛋白乙酰化水平与RAR-β2表达及宫颈病变程度的关系。结果：随着宫颈病变的进展，AcH3、RAR-β2和Involucrin的表达逐渐降低，甚至缺失，组间差异有统计学意义（P＜0.05）；组蛋白乙酰化水平与RAR-β2表达呈正相关（r=0.797，P＜0.05），AcH3和RAR-β2的表达均与宫颈病变程度呈负相关［r=-0.547（AcH3），r=-0.585（RAR-β2），P＜0.05］。结论：组蛋白乙酰化修饰与RAR-β2表达调控有关，并可能参与宫颈癌的发生。

组蛋白乙酰化修饰 RAR-β2宫颈上皮内瘤变 宫颈鳞状细胞癌 分化

Department of Obstetrics and Gynecology,Anhui Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University,Anhui Provincial

Key Laboratory of Molecular Medicine,Hefei 230001,China.

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China(Grant Nos.81072127 and 30901606),Anhui Pro

vincial Natural Science Foundation(Grant No.11040606M176),and Scientific Research Foundation of Universities and Colleg

es,Anhui Medical University(No.2012XKJ046).

宫颈癌是女性最常见的生殖道恶性肿瘤之一，其病因与高危型HPV感染宫颈上皮基底细胞，导致上皮分化成熟障碍，继而恶性转化；病变经历了宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级到宫颈癌的渐进过程，但具体机制仍不明确。RAR-β2是一种重要的肿瘤抑制基因，在上皮细胞分化过程中发挥重要的调控作用，其表达降低/缺失与多种肿瘤的发生密切相关［1-2］。最新的研究证实，组蛋白乙酰化修饰通过表观遗传途径调控多种与细胞周期、分化、凋亡相关基因的表达，通过与RAR-β2基因启动子区RARE直接作用，调控RAR-β2的表达，与肿瘤发生密切相关［3-4］。本研究拟检测不同宫颈病变组织中组蛋白乙酰化水平及RAR-β2的表达情况，分析两者之间的相关性，从而探讨其与宫颈癌发生发展的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例与组织标本来源 收集安徽医科大学附属省立医院2011年1月至2012年9月间CINⅡ～Ⅲ和宫颈鳞状细胞癌（cervical squamous cell carcinoma，SCC）石蜡包埋标本56例。其中CINⅡ～Ⅲ26例，SCC 30例；依据FIGO（2009年）宫颈癌临床分期，Ⅰ期22例（Ⅰa期10例，Ⅰb期12例），Ⅱ期8例（全部为Ⅱa期）；选择因子宫肌瘤行子宫全切的正常宫颈组织10例作对照。

收集2012年5～11月间手术切除的新鲜宫颈病变组织16例，其中，CINⅡ～Ⅲ8例（阴道镜活检下病理确诊为CINⅡ～Ⅲ的宫颈病变部位，在LEEP术前用活检钳取上述部位），SCC 8例，Ⅰ期5例（Ⅰa期2例，Ⅰb期3例），Ⅱ期3例（全部为Ⅱa期），收集因子宫肌瘤行子宫全切的正常宫颈组织6例作对照。所有标本均保存于-80°C冰箱中待用。

以上全部病例手术前均未行放化疗、免疫治疗及其它特殊治疗，病例资料完整。

1.1.2 试剂 AcH3单克隆抗体、RAR-β2多克隆抗体、Involucrin单克隆抗体、GAPDH单克隆抗体均购于美国Santa Cruz公司。免疫组织化学染色SP试剂盒、抗原修复液、DAB显色剂及Western Blot用辣根过氧化物酶标记IgG的山羊抗兔、抗小鼠二抗均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色（SP法） 石蜡切片脱蜡至水，枸橼酸盐缓冲液抗原修复，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，滴加一抗4°过夜（AcH3、RAR-β2、Involucrin抗体稀释度分别是1∶50、1∶50、1∶100），滴加聚合物辅助剂室温20 min，滴加辣根酶标记的相应二抗室温20 min，DAB染色，苏木素复染，脱水，透明，封片。PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性标本作阳性对照。

结果判定标准：以细胞质或细胞核出现黄色或棕黄色颗粒为AcH3、RAR-β2表达阳性细胞，以细胞膜/质出现黄色或棕黄色为Involucrin表达阳性细胞。每张切片按着色强度分为，0分：无染色，1分：弱表达，2分：中表达，3分：高表达；每张切片选择5个不同视野（×200），按着色细胞百分比，取5个视野的平均值即为每张切片的阳性细胞率，0分：阴性，1分：＜10%，2分：11%～50%，3分：51%～80%，4分：＞80%。以强度和面积得分的乘积评价表达情况［5］，范围0～12分，0分：阴性（-），1～4分：低表达，＞4分：高表达。

1.2.2 Western Blot 在冰上剪碎CINⅡ～Ⅲ和SCC组织、提取总蛋白并定量，以40 μg蛋白上样，经SDS-PAGE凝胶电泳分离、电转、5%脱脂奶粉封闭（TBS-T稀释）、一抗孵育4℃过夜（AcH3、RAR-β2、Involucrin、GAPDH稀释度分别是1∶100、1∶100、1∶500、1∶2 000）、对应二抗（1∶1 000）室温孵育2 h、化学发光法显影。运用Alpha Innotech成像系统采集图像，对条带光度扫描，检测各目的蛋白与其对应内参的OD值，以各OD目的蛋白/OD内参比值，取平均值统计分析。

1.3 统计学方法

应用SPSS 13.0软件行χ2检验和t检验，相关性分析采用Spearman分析；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组织化学检测

AcH3、RAR-β2、Involucrin在正常宫颈、CINⅡ～Ⅲ和SCC组织中的表达（图1）。AcH3、RAR-β2主要定位于细胞质或细胞核，Involucrin主要定位于细胞膜/质。AcH3、RAR-β2、Involucrin在正常宫颈组织的阳性表达率分别是100%、90%、100%（10/10、9/10、10/10），显著高于CINⅡ～Ⅲ组织84%、76%、88%（22/26、20/26、23/26）及SCC组织46%、46%、33%（14/30、14/30、10/30）；在宫颈病变过程中，AcH3、RAR-β2、Involucrin表达逐渐降低，甚至缺失，三者的表达在各组间差异均有统计学意义（P＜0.05，表1）。

2.2 组蛋白乙酰化水平与RAR-β2表达的相关性

Spearman相关性分析结果显示，组蛋白乙酰化水平与RAR-β2的表达呈正相关（r=0.797，P＜0.05，图2），即随着宫颈病变的进展，两者表达同步降低。这与文献报道一致［3］，在宫颈病变上皮细胞中RAR-β2的表达受组蛋白乙酰化水平的调控。

2.3 AcH3、RAR-β2与宫颈病变程度的相关性

在正常宫颈、CINⅡ～Ⅲ、SCC组织中AcH3和RAR-β2的表达均依次降低，即宫颈病变越重，两者的表达越低，与病变程度呈负相关［r=-0.547（AcH3），r=-0.585（RAR-β）2，P＜0.05，图3］。

2.4 Western Blot检测

AcH3、RAR-β2、Involucrin在正常宫颈、CINⅡ～Ⅲ和SCC组织中的表达见图4。结果显示，AcH3、RAR-β2、Involucrin的表达与免疫组化结果一致，在正常宫颈、CINⅡ～Ⅲ、SCC组织中逐渐降低。

3 讨论

基因的表达除了决定于DNA序列所传递的遗传学信息外，还决定于DNA序列以外的表观遗传学信息。随着对肿瘤认识的深入，利用表观遗传学机制揭示肿瘤的发生发展受到众多学者的关注，并认为是肿瘤病理生理过程中最重要的分子事件之一。组蛋白乙酰化修饰在表观遗传学理论中占有重要地位，通过影响细胞内染色质结构，参与特定位点的基因转录调控，在细胞生长、分化过程中发挥关键作用；组蛋白富含赖氨酸、精氨酸、组氨酸等带正电荷的碱性氨基酸，所谓的组蛋白乙酰化修饰是指组蛋白八聚体向外延伸的碱性氨基酸残基乙酰化，通过增大DNA与组蛋白间的静电引力和空间位组，两者间相互作用减弱，选择性的使某些染色质区域的结构从紧密变得松散，DNA易于解聚，染色质呈转录活性结构，有利于转录因子与DNA模板相结合，继而开放某些基因转录，增强其表达水平；相反，组蛋白去乙酰化，即乙酰化水平降低，使带正电荷的组蛋白与带负电荷的DNA紧密结合，染色质呈卷曲致密的抑阻结构，从而抑制基因转录，导致调控细胞周期、分化、凋亡的基因转录失调。正常细胞内组蛋白乙酰化和去乙酰化处于平衡，动态控制靶基因的稳定表达，调控细胞在适当的时间和空间位置上表达适当的基因，维持细胞正常的生理功能和表型，控制细胞的增殖分化；当乙酰化和去乙酰化失衡，组蛋白乙酰化水平降低时，将引起相应染色质结构和基因转录改变，影响细胞周期、分化、增殖、凋亡相关基因的表达，而导致肿瘤的发生和进展。在肿瘤细胞中组蛋白大多数呈去乙酰化状态［6-9］，随着乙酰化水平的降低，组织的异质性程度也逐渐增加［10］；本实验显示，从正常宫颈、CIN、SCC组织中组蛋白乙酰化水平逐渐降低，甚至缺失，与不同病变卵巢组织的研究结果相似［10］，组蛋白乙酰化水平与宫颈病变程度呈负相关，说明表观遗传修饰参与宫颈癌的发生发展。

维甲酸（retinoic acid，RA）又称视黄醇或维生素A酸，是维生素A的衍生物，机体内一定浓度的维甲酸可调节细胞的分化、增殖、成熟，是正常生长发育和各种生理活动必不可少的因子之一。RA是通过与细胞核内维甲酸受体（retinoic acid receptor，RAR）结合而调节细胞的增殖、分化和成熟，发挥广泛的生物学效应。RAR-β2是RAR-β家族中最重要的成员，也是RA可诱导的主要亚型，与RA结合调控细胞生长，促进细胞分化等而产生抗肿瘤活性，因此，RAR-β2在多种肿瘤中认为是一个肿瘤抑制基因。RAR-β2不但在癌组织中表达减少或缺失，而且在癌前病变组织中的表达同样是减少或缺失［11-12］，这说明RAR-β2与肿瘤的发生紧密相关。利用转染RAR-β2的肿瘤细胞株发现，通过诱导肿瘤细胞分化而增加凋亡［13］，其缺失与肿瘤组织的分化程度有关［14］。Involucrin作为上皮细胞终末分化的标记蛋白，是分化成熟的上皮细胞应具备的功能蛋白，Involucrin的表达说明该细胞逐渐向正常分化成熟的方向发展或为分化成熟的上皮细胞，其表达水平与肿瘤细胞的分化程度密切相关，高分化的肿瘤细胞中较中低分化的肿瘤细胞中的表达显著增多，是判断肿瘤细胞分化程度的重要标记之一。本研究结果显示，在正常宫颈、CIN、SCC组织中RAR-β2与Involucrin表达水平均依次降低，各组间的表达水平有显著差异性，表明正常宫颈组织在转变为CIN的过程中，上皮细胞中RAR-β2与Involucrin同步发生了变化，使分化成熟的上皮细胞逐渐减少，甚至缺失，增加组织的异质性，导致宫颈癌的发生。

组蛋白作为染色质基本结构核小体的重要组成部分，翻译后乙酰化修饰引起染色质结构重塑在细胞周期、分化、凋亡的基因转录调控中发挥关键作用［6］。有研究表明，RAR-β2基因启动子沉默与组蛋白乙酰化修饰有关，并参与肿瘤的发生［3-4］，即组蛋白乙酰化平衡动态调控细胞生长分化，组蛋白乙酰化状态减少，使细胞去分化、过度增殖，导致肿瘤发生。本课题组前期宫颈癌SiHa、HeLa细胞和裸鼠成瘤实验结果显示，组蛋白去乙酰化酶抑制剂联合ATRA（RA化合物）通过显著上调组蛋白乙酰化水平而重启宫颈癌细胞RAR-β2的表达，促进上皮细胞终末分化标记Involucrin表达的上调，使肿瘤细胞停滞在G1期，抑制肿瘤细胞生长，从而缩小肿瘤体积，发挥协同抗宫颈癌作用［15］；结合本次利用临床组织研究显示，随着宫颈病变的进展，组蛋白乙酰化程度越低，RAR-β2的表达也越低，两者的表达呈正相关，同时，AcH3和RAR-β2均与宫颈病变程度呈负相关；表明组蛋白乙酰化修饰参与调控RAR-β2的表达，其乙酰化水平越低，导致RAR-β2表达减少，甚至缺失，使宫颈上皮基底细胞分化成熟障碍、出现恶性转化和细胞周期异常，从而参与宫颈癌的发生发展过程。

1 Ralhan R,Chakravarti N,Kaur J,et al.Clinical significance of altered expression of retinoid receptors in oral precancerous and cancerous lesions：Relationship with cell cycle regulators[J].Int J Cancer,2006,118(5)：1077-1089.

2 Huang H,Wang LF,Tian HM,et al.Expression of retinoic acid receptor-β mRNA and p16,p53,Ki67 proteins in esophageal carcinoma and its precursor lesions[J].Chin J Oncol,2005,27(3)：152-155.［黄 泓,王力峰,田海梅,等.维甲酸受体-β等肿瘤分子标志物在食管正常及异常组织中的表达及意义[J].中华肿瘤杂志,2005,27(3)：152-155.］

3 Zhang Z,Joh K,Yatsuki H,et al.Retinoic acid receptor beta2 is epigenetically silenced either by DNA methylation or repressive histone modifications at the promoter in cervical cancer cells[J].Cancer Lett,2007,247(2)：318-327.

4 Feng DQ,Wu J,Tian Y,et al.Targeting of histone deacetylases to reactivate tumour suppressor genes and its therapeutic potential in a human cervical cancer xenograft model[J].PLoS ONE,2013,8 (11)：e80657.

5 Cheng Y,Zhou Y,Jiang W,et al.Significance of E-cadherin, β-catenin,and vimentin expression as postoperative prognosis indicators in cervical squamous cell carcinoma[J].Human Pathol,2012, 43(8)：1213-1220.

6 Mahlknecht U,Hoelzer D.Histoneacetylation modifiers in the pathogenesis of malignant disease[J].Mol Med,2000,6(8)：623-644.

7 Berqada L,Sorolla A,Yeramian A,et al.Combination of Vorinostat and caspase-8 inhibition exhibits high anti-tumoral activity on endometrial cancer cells[J].Mol Oncol,2013,7(4)：763-775.

8 Mateen S,Raina K,Jain AK,et al.Epigenetic modifications and p21-cyclin B1 nexus in anticancer effect of histone deacetylase inhibitors in combination with silibinin on non-small cell lung cancer cells[J].Epigenetics,2012,7(10)：1161-1172.

9 Meng F,Sun G,Zhong M,et al.Inhibition of DNA methyltransferases,histone deacetylases and lysine-specific demethylase-1 suppresses the tumorigenicity of the ovarian cancer ascites cell line SKOV3[J].Int J Oncol,2013,43(2)：495-502.

10 JiaY,Zou YG,Chen J,et al.Expression of Histone Deacetylase 1 in human epithelial ovarian cancer[J].Chin J Lab Diagn,2011,15(2)：256-258.［贾 研,邹颖刚,陈 军,等.组蛋白去乙酰化酶1在上皮性卵巢癌组织中的表达[J].中国实验诊断学,2011,15(2)：256-258.］

11 Tang M,Wu Q,Wu ZS,et al.Differential expression of COX-2 and RAR-β2and their association in esophageal cancer tissue specimens[J]. Acta Univ Medi Anhui,2012,47(4)：450-453.［唐 曼,吴 强,吴正升,等.COX-2、RAR-β2在食管鳞状细胞癌组织中的表达及相互关系[J].安徽医科大学学报,2012,47(4)：450-453.］

12 Zhong JH,Wang Y,Wang XC,et al.Expression and significance of retinoic acid receptor-β in cervical cancer[J].China of Care Health Child Maternal,2013,28(18)：2991-2994.［衷敬华,王 勇,王祥财,等.维甲酸受体β在宫颈癌中的表达及其意义[J].中国妇幼保健,2013,28(18)：2991-2994.］

13 Toulouse A,Loubeau M,Morin J,et al.RARbeta involvement in enhancement of lung tumor cell immunogenicity revealed by array analysis[J].FASEB J,2000,14(9)：1224-1232.

14 Xie F,Xiang XY,Zhang JC,et al.Methylation of retinoic acid receptor β2 promoter in sporadic breast cancer tissue[J].Canc Res on Prev Trea,2011,38(4)：408-415.［谢 飞,向希映,张吉才,等. RAR-β2基因启动子异常甲基化与散发性乳腺癌的关系[J].肿瘤防治研究,2011,38(4)：408-415.］

15 Feng D,Cao Z,Li C,et al.Combination of Valproic Acid and ATRA Restores RAR2 Expression and Induces Differentiation in Cervical Cancer through the PI3K/Akt Pathway[J].Curr Mol Med, 2012,12(3)：342-354.

（2013-07-15收稿）

（2013-10-24修回）

（本文编辑：贾树明）

Correlation between cervical lesion development and histone acetylation modification that regulates RAR-β2expression

Jiaojiao WU,Dingqing FENG,Yuan TIAN,Hanjie XU,Bing LI,Bin LING
Correspondence to:Bin LING;E-mail:lingbin.ling@gmail.com

Objective:To investigate the relationship between cervical lesion development and histone acetylation that regulates RAR-β2expression.Methods:Immunohistochemistry and Western blot analysis were performed to detect AcH3,RAR-β2,and involucrin expression in normal cervical tissues as well as in tissues with cervical intraepithelial neoplasia(CIN)Ⅱ-Ⅲand squamous cell cervical carcinoma.The relationship among histone acetylation level,RAR-β2expression,and cervical lesion severity were analyzed.Results:AcH3,RAR-β2,and involucrin expression were reduced or absent with the progression of cervical lesions;significant differences were noted between the groups(P＜0.05).Histone acetylation level and RAR-β2expression were positively correlated(r=0.797,P＜0.05).AcH3 and RAR-β2expression,which were both associated with the cervical lesions,were negatively correlated[r=-0.547(AcH3), r=-0.585(RAR-β2),P＜0.05].Conclusion:Histone acetylation modification is associated with the regulation of RAR-β2expression.This process is also likely to participate in the carcinogenesis of cervical carcinoma.

histone acetylation modification,RAR-β2,cervical intraepithelial neoplasia,squamous cell cervical carcinoma,differentiation

10.3969/j.issn.1000-8179.20131140

伍娇娇 硕士，主治医师。研究方向为妇科肿瘤临床与基础研究。

安徽医科大学附属省立医院妇产科，安徽省分子医学重点实验室（合肥市230001）

*本文课题受国家自然科学基金项目（编号：81072127，30901606）、安徽省自然科学基金项目（编号：11040606M176）和安徽医科大学高校科研基金项目（编号：2012XKJ046）资助

凌斌 lingbin.ling@gmail.com

E-mail：wubaiwanzjs@163.com