猪繁殖与呼吸综合征检测方法及其中草药防治的综述

刘笛秋

（湖南省益阳市赫山区畜牧水产局，湖南益阳 413002）

猪繁殖与呼吸综合征检测方法及其中草药防治的综述

刘笛秋

（湖南省益阳市赫山区畜牧水产局，湖南益阳 413002）

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起，以繁殖母猪出现繁殖障碍、早产、流产、死胎和木乃伊胎，仔猪呼吸综合征为特征的高度接触性传染病。本文综述了猪繁殖与呼吸综合征的RT-PCR和ELISA两种检测方法、中草药添加剂对猪繁殖与呼吸综合征的防治作用，以期为养猪者在生产中检测和防控PRRS起到参考作用。

PRRS；RT-PCR；ELISA；中草药添加剂

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）俗称“蓝耳病”，由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起，临床上主要表现为体温明显升高、眼结膜炎、眼睑水肿、咳嗽、气喘，部分猪只表现为后躯无力、不能站立或共济失调等神经症状。繁殖母猪出现繁殖障碍、早产、流产、死胎和木乃伊胎，可造成30%以上的流产率；仔猪表现为呼吸综合征，仔猪发病率高达100%，死亡率也达50%以上。

PRRSV为一种有囊膜的单股正链RNA病毒，具有高度的变异性。目前我国分离得到的毒株主要来源于RNA序列存在50%～70%相似度的欧洲毒株（Lelystad病毒）和北美洲毒株（VR-2332）两个原型。PRRSV可以水平传播和垂直传播，康复猪也可以在恢复过程中的2～3个月持续通过分泌物、粪便、尿液等向外排毒，饲养环境、人员、转运等都可以成为病毒的传播途径。我国2006—2007年的养猪业遭受过PRRS的大流行，造成了巨大的经济损失，随着灭活苗和弱毒活疫苗的使用，目前已得到较好的控制，仅在局地还有流行，但仍不可对此掉以轻心。

本文综述了PRRS的RT-PCR和ELISA两种检测方法、中草药添加剂对PRRS的防治作用，以期为养猪者在生产中检测和防控PRRS起到参考作用。

1 PRRSV的检测

1.1 反转录酶-聚合酶链反应（RT-PCR）检测

RT-PCR是目前公认的检测PRRSV最为快捷、有效的方法，主要包括常规RT-PCR、套式RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR等，这三种方法各有优缺点。常规RT-PCR能够特异、敏感地检测出样品中的PRRSV；套式RT-PCR使用两对引物进行脱氧核糖核酸片段的特异性扩增，在特异性和敏感性上有很大提高；而实时荧光定量RT-PCR利用了荧光信号的积累，实时监测整个PCR进程，不仅实现了对脱氧核糖核酸模板的定量，而且其敏感度、特异性和可靠性更高，自动化程度高，具有无污染、实时性和准确性高等特点[1-3]。

试验研究也证实，RT-PCR是一种快捷、有效、可靠的检测PRRSV的方法。郝晓芳等[4]建立了一种PRRSV的RT-PCR检测方法，该方法扩增高致病性PRRSV基因组时，可获得230 bp的片段，扩增经典型PRRSV时，则获得320 bp的片段，根据RT-PCR产物大小可将二者区分开来。通过大量临床病料的检测，并配合PCR产物测序验证，结果表明该方法简便、快速、特异，可以鉴别高致病性PRRSV，为进一步的PRRS流行病学研究提供了重要的技术手段。安春霞等[5]以高致病性和低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP/LPPRRSV）混合物总RNA为反转录模板，成功建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV二重RT-PCR检测方法，该方法灵敏度高，最低检出限均为100拷贝/μL；重复性好，特异性强，可特异性地扩增出HP-PRRSV细胞培养物和LP-PRRSV疫苗毒。郑鸣等[6]成功建立了PRRSV环介导间接PCR检测方法，能有效鉴别HP/LP-PRRSV，可检测出5.6 TCID50/mL LP-PRRSV和18 TCID50/mL HP-PRRSV的病毒RNA，HP/LP-PRRSV混合感染不影响检测灵敏度，环介导间接PCR是一种简便快速、灵敏、特异的病原学诊断工具，适合PRRSV感染的快速检测，尤其适合HP/LP-PRRSV混合感染的鉴别。吴忆春[7]建立了PRRSV荧光定量PCR检测方法，灵敏度达130拷贝/μL，与其他病毒不发生交叉反应，具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点，可用于临床PRRS的诊断。张靖飞等[8]建立了一种快速检测PRRSV并且能够区分普通毒株和高致病性毒株的双重荧光PCR方法，将该方法应用于临床标本的检测，通过对32份样本的检测，检出阳性为28份，阳性率为87.5%，高致病性毒株为17份，阳性率为59.38%，表明建立的方法可以用于PRRSV的快速检测，并且可以区分普通株和高致病性株。

1.2 酶联免疫吸附（ELISA）检测法

ELISA是一种生物活性物质微量测定新技术，广泛应用于生命科学各领域，通过不断改进，形成了包括竞争ELISA、斑点ELISA、SPA-ELISA、双抗体夹心ELISA、单抗体夹心LAB-ELISA以及血清学鉴别ELISA等，在检测的灵敏度、特异性、操作简便性以及实时性、高效性等方面都有很大提高。ELISA算是当前应用最广、发展最快的一项微量测定技术[9]。孙晶等[10]建立了HP-PRRSV基因缺失标记疫苗ELISA鉴别诊断方法，结果显示批内和批间重复试验结果变异系数均低于10%，具有良好的重复性，对临床血清检测结果显示，与IDEXX试剂盒检测结果的符合率达94.84%，该方法为PRRSV基因工程标记弱毒疫苗株在临床鉴别诊断的应用提高了有利保障。夏平安等[11]利用纯化融合蛋白作包被抗原及优化ELISA反应条件，建立了可检测抗PRRSV N蛋白抗体的间接ELISA方法(N-ELISA)，并利用所建立的N-ELISA与国外进口的PRRS检测试剂盒IDEXX-ELISA，对200份临床送检血清进行平行检测，阳性符合率为92.7%。结果表明，本试验建立的N-ELISA的特异性接近IDEXX-ELISA。江云波等[12]以纯化的融合蛋白为抗原，建立了猪繁殖与呼吸综合征P5 6 ELISA检测方法，与国外试剂盒IDEXX-ELISA总符合率为94.1%，表明建立的P5 6 ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。陈如敬等[13]建立的检测PRRSV抗体的间接ELISA方法，对免疫猪繁殖与呼吸综合征疫苗4周后的70份猪血清进行检测，其OD450nm值均大于0.85，表明其建立的重组GP5表位蛋白间接ELISA方法可用于临床样品的监测。陈攀等[14]建立了PRRSV GP5蛋白的ELISA方法，用于评价猪群疫苗免疫或感染后抗体水平与免疫保护力之间的关系，结果表明特异性和重复性均较好，与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪口蹄疫病毒血清抗体无交叉反应。

2 中草药添加剂的防治作用

2.1 直接抗病毒作用

直接抗病毒作用主要是指中药添加剂通过阻断病毒增殖过程中的吸附、传入、复制和成熟中的某个环节而达到抗病毒的作用。冼琼珍等[15]证实，板蓝根、黄芩、青蒿对PRRSV有阻断作用，穿心莲、夏枯草、板蓝根、黄芪、连翘、芦根、青蒿有抑制病毒作用，青蒿、连翘、板蓝根、黄芪、穿心莲、黄芩有明显的杀灭病毒作用；还证实了鱼腥草、菊花、山银花、知母、桂枝、麻黄、赤芍、柴胡、贯众、栀子、薄荷叶、水牛角、地胆草共13种中药有不同程度的抗PRRSV作用，综合阻断、抑制、杀灭3种作用方式，鱼腥草、菊花、知母、桂枝、赤芍作用效果最好，麻黄、柴胡、贯众效果次之[16]。胡梅等[17]研究表明，在安全浓度范围内，板蓝根水提物体外对PRRSV具有显著的直接杀灭作用，连翘、黄芪水提物和黄芪多糖体外对PRRSV均具有明显的阻断和抑制作用，为筛选抗PRRSV中药制剂提供了理论依据。王学斌等[18]研究表明，板蓝根能够抑制PRRSV体外增殖，最小灭菌浓度和阻断浓度分别0.195、0.097 mg/mL，而黄芪对PRRSV增殖的抑制作用较弱，板蓝根和黄芪联合使用时对PRRSV抑制作用显著增强，该课题组还证实在安全浓度范围内，板蓝根多糖体外对PRRSV具有较好的阻断和抑制作用，最小阻断和抑制浓度分别为2.094、8.375 μg/mL[19]。陈峰等[20]证实，金银花提取物大孔树脂600 mL/L的乙醇/水洗脱部位对PRRSV感染细胞具有较好的保护效果，最小保护浓度为6.25 μg/mL，可使PRRSV ORF7 mRNA含量降低1 000多倍。周洪锐等[21[22]研究表明，在安全浓度范围内，绿原酸对PRRSV具有显著的体外抑制作用和阻断作用，其对PRRSV的最小抑制浓度和阻断浓度分别为0.391、0.0977 μg/mL。贺晶晶等[23]在确定青黛、花椒、卫矛和沉香4种提取物的半数毒性浓度和最大无毒浓度基础上，在浓度分别达到422.7、291.2、160.2、44.9 μg/mL时均能抑制PRRSV NP蛋白基因的表达，对PRRSV的增殖具有显著的抑制效果，以卫矛提取物的效果最佳。

2.2 间接抗病毒作用

中草药添加剂和氨基酸可通过提高注射疫苗后的猪只抗体水平，从而发挥其抗PRRSV的作用。张红英等[24]研究了板蓝根多糖对PRRS灭活疫苗免疫T细胞亚群和抗体的影响，结果表明板蓝根多糖能显著提高仔猪的CD3+、CD8+淋巴细胞的比例和特异性抗体滴度，从而证实板蓝根多糖能显著增强猪对常规灭活病毒疫苗的免疫应答能力。邵删等[25]研究表明黄芪多糖和白花蛇舍草多糖均能显著提高仔猪的CD3+、CD8+、CD4+淋巴细胞的百分比和特异性抗体滴度，即黄芪多糖和白花蛇舍草多糖均能显著提高猪高致病性繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的免疫水平，且白花蛇舍草多糖提高免疫的效力与剂量有关。吴瑗等[26]研究表明芦荟多糖高低剂量在PRRSV灭活苗免疫的中后期差异显著，高剂量芦荟多糖组在免疫后第54天抗体水平比对照组抗体高出73.5%；对于活疫苗，高剂量芦荟多糖能显著提高抗体水平，而低剂量芦荟多糖对抗体的产生无显著作用。此外，王军等[27]研究表明，饲粮中添加苏氨酸和色氨酸可上调TLR3、TLR7、TLR8 mRNA的相对表达量，表明PRRS弱毒苗可能激活TLR3、TLR7、TLR8信号通路，进而提高血清免疫球蛋白含量，促进炎症细胞因子产生，最终强化获得性免疫。

3 小结

综上所述，RT-PCR和ELISA两种检测方法能较好地检测出PRRSV，具有重复性、特异性、可靠性强等优点，在生产实践中可以得到较好的推广应用；中草药添加剂可通过阻断病毒增殖过程中的吸附、传入、复制和成熟中的某个环节而达到抗病毒的作用，也可以通过提高注射疫苗后的猪只体内的抗体水平，从而发挥其抗PRRSV的作用，但是目前有关中草药添加剂抗PRRSV的研究还局限于体外试验，有待于进一步在动物体内水平对其作用效果进行研究。

[1]魏津,王在时.猪繁殖与呼吸综合征病毒检测技术的研究进展[J].北方牧业,2014(4):15-16.

[2]陈进会,黄伟,颜其贵,等.PRRS检测技术的研究进展[J].检验检疫学刊,2010,20(3):61-64,73.

[3]官家明,施开创,陈汉忠,等.猪繁殖与呼吸综合征病毒检测技术研究进展[J].动物医学进展,2013,34(8):88-92.

[4]郝晓芳,周艳君,田志军,等.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立[J].中国预防兽医学报,2007,29 (9):704-709.

[5]安春霞,闫若潜,吴志明,等.高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用[J].中国畜牧兽医,2013,40(5):66-70.

[6]郑鸣,李华玮,边传周,等.环介导间接PCR鉴别高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒方法的建立[J].病毒学报,2013,29(4): 364-373.

[7]吴忆春.猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立[J].动物医学进展,2013,34(2):20-24.

[8]张靖飞,张园,李志辉,等.猪繁殖与呼吸综合征病毒双重荧光RT-PCR检测方法的建立[J].动物医学进展,2013,34(4):74-77.

[9]韩庆功,崔艳红.ELISA检测技术在猪繁殖与呼吸综合征诊断中的应用[J].河南科技学院学报（自然科学版）,2008,36(1):66-69.

[10]孙晶,周艳君,姜一峰,等.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒基因缺失标记疫苗ELISA鉴别诊段方法的建立[J].中国动物传染病学报,2014,22(1):30-36.

[11]夏平安,尹彦涛,李素平,等.猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白的高效表达及间接ELISA方法的建立[J].中国兽医学报, 2009,29(5):537-541.

[12]江云波,方六荣,肖少波,等.猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5-M在大肠杆菌中的融合表达及其ELISA诊断方法的建立[J].生物工程学报,2005,21(2):259-264.

[13]陈如敬,吴学敏,车勇良,等.串联表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5表位蛋白间接ELISA方法的建立[J].中国畜牧兽医,2014, 41(4):43-46.

[14]陈攀,郑芳园,李玉峰.猪繁殖与呼吸综合征病毒截短GP5蛋白间接ELISA方法的建立[J].畜牧与兽医,2014,46(4):36.

[15]冼琼珍,王丙云,丘顺寿,等.10种中药体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用研究[J].黑龙江畜牧兽医,2014,40(1):133-136.

[16]冼琼珍,王丙云,伍盛鋆,等.16种中药体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用研究[J].中国畜牧兽医,2014,41(2):245-249.

[17]胡梅,崔保安,张红英,等.板蓝根、黄芪等中药活性提取物对猪繁殖与呼吸综合征病毒体外作用的研究[J].中兽医医药杂志, 2006,25(6):14-17.

[18]王学斌,魏战勇,崔保安,等.板蓝根、黄芪对猪繁殖与呼吸综合征病毒的体外抑制作用[J].畜牧与兽医,2006,38(4):11-14.

[19]王学兵,崔保安,魏战勇,等.板蓝根多糖的提取及其对猪繁殖与呼吸综合征病毒的体外作用[J].江苏农业学报,2009,25(2):311-314.

[20]陈峰,江玉婷,于云飞,等.金银花提取物体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒研究[J].动物医学进展,2012,33(2):41-45.

[21]周洪锐,汤起武,余兴龙,等.4种茶叶水提物对猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用[J].湖南农业大学学报（自然科学版）,2012,38 (3):305-309.

[22]王学兵,崔保安,魏战勇,等.绿原酸对猪繁殖与呼吸综合征病毒体外作用的研究[J].中国农业科技导报,2008,10(3):107-110.

[23]贺晶晶,代飞燕,李文贵,等.天然中草药提取物抗猪繁殖与呼吸综合征病毒活性研究[J].云南农业大学学报,2013,28(4):494-499.

[24]张红英,赵现敏,崔保安,等.板蓝根多糖对猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫猪T细胞亚群的影响[J].中国免疫学杂志,2007,23(2): 134-137.

[25]邵珊,王贵平,李春玲,等.黄芪多糖和白花蛇舍草多糖对猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫猪T细胞亚群及抗体水平的影响[J].中国兽医学报,2011,31(8):1196-1199.

[26]吴瑗,张晓菊,应志锐,等.芦荟多糖对猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫猪抗体的影响[J].家畜生态学报,2012,33(3):80-83.

S858.28

B

1673-4645(2014)12-0043-04

2014-08-19

刘笛秋，男，湖南益阳人，兽医师，主要从事猪病防治工作