HGK在肿瘤中的研究进展*

马宝杰 综述 牛远杰 审校

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HGK在肿瘤中的研究进展*

马宝杰 综述 牛远杰 审校

HGK属于生发中心激酶（GCK）Ⅳ中的一员，参与细胞运动、细胞骨架重排和细胞增殖，与肿瘤的发生密切相关。HGK在卵巢癌、肝癌、肺癌、胰腺癌及前列腺癌等多种肿瘤中高表达，有可能成为肿瘤治疗的新作用靶点或预防某些肿瘤的发生。本文就HGK在肿瘤中的研究进展及可能的作用机制进行综述。

肿瘤 HPK/GCK样激酶 信号传道通路

丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）是一组可以被多种细胞外信号（紫外线、生长因子、细胞因子及应激诱导剂等）激活的丝/苏氨酸激酶，MAPKs通过磷酸化的形式依次被其上游的MAPK激酶（MKKs）及MKK激酶（MKKKs）激活，激活后通过磷酸化转录因子参与调节细胞的多种生物学行为如细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡，在炎症、应激和肿瘤发生过程中起关键性作用［1-2］，此所谓MAPK信号系统的瀑布式激活方式。丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶激酶4（MAP4K4，亦称为HGK）属于MAPK信号系统的上游激酶，MAP4K4在多种肿瘤细胞中高表达，可加速细胞转化，促进细胞侵袭以及减少与细胞的粘附性。本文主要对MAP4K4在肿瘤中的作用及其机制作一综述。

1 MAP4K4的性质

丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶激酶4（MAP4K4）又称为HGK（hepatocyte progenitor kinase-like/germinal center kinase-like kinase，HPK/GCK样激酶），系丝/苏氨酸激酶亚家族STE20中的一员，位于染色体2q11.2，含有33个外显子，编码区包括9个可选择的剪接位点［3］。STE20家族是MAPKKK的上游激酶，哺乳类动物STE20/丝裂原蛋白激酶激酶激酶激酶（MAP4K）家族由其催化区相关的28种丝氨酸/苏氨酸激酶组成。这些激酶根据催化区的位置可分为两种结构类别：催化区位于C末端的P21活性蛋白激酶（PAKs）和催化区位于N末端的生发中心激酶（GCKs）。GCKs缺乏PAKs中与Cdc42/Rac相互作用的N-末端调节区，而代之以N-末端催化区和不同长度的C-末端延伸。C-末端是一个枸椽同源区（CNH），称为枸椽rho相互作用激酶（CRIK），该区域对于激酶活性节起着重要作用。GCKs在激酶区域外显示出低度同源性，并分为8个亚家族。MAP4K4是GCKⅣ组中的一个成员，它对细胞的作用包括调节细胞的运动性，细胞骨架重排以及细胞增殖等［4］。

2 MAP4K4在肿瘤细胞系中的研究

2.1 MAP4K4在肿瘤细胞系中的表达

Wright等［4］收集了60种肿瘤细胞系和各种正常组织，通过RNA纯化及Northern blot分析所有剪接变异体中MAP4K4保守区的400碱基片断。结果显示，在正常组织中，MAP4K4仅在大脑和睾丸中轻微表达。相反，在60种肿瘤细胞系中有40种细胞的MAP4K4 mRNA高度表达。

2.2 MAP4K4在细胞转化、侵袭中的作用

MAP4K4在肿瘤中的过度表达揭示其在肿瘤的发生中起重要作用。Wright等［4］在哺乳类表达载体中构建MAP4K4的突变等位基因并在组织培养细胞中检测其在细胞转化中的作用。基于与其他相关激酶的同源性，MAP4K4活化环中苏氨酸187和苏氨酸191被认为是潜在的调节磷酸化位点。研究者们分别把苏氨酸187和苏氨酸191突变为谷氨酸（分别命名为T187E及T191E），把起催化作用的赖氨酸54突变为精氨酸（命名为K54R），其中T187E为MAP4K4的有活性突变体，T191E和K54R为MAP4K4的无活性突变体。将NIH3T3细胞中不同的MAP4K4等位基因与H-Ras的活化等位基因H-Rasv12共表达，MAP4K4非活性等位基因K54R相对于野生型MAP4K4基因在与H-Rasv12共表达时其集落形成率降低了50%。另外，野生型MAP4K4与H-Rasv12的共表达可增加H-Rasv12导致的集落形成，在共转染H-Rasv12和无活性的MAP4K4的RIE-1细胞中也发现类似的集落形成被抑制。这些结果表明MAP4K4激酶的活性对于Ras诱导的细胞转化起非常重要作用。

为了研究MAP4K4在定向侵袭中的作用。研究者们［4］把RIE-1细胞接种于transwell小室，然后检测其侵袭率。过度表达野生型MAP4K4的RIE-1细胞显示出明显增加HGF诱导的迁移。相反，表达无活性的MAP4K4可明显阻碍其侵袭性。

Collins等［5］发现MAP4K4在SKOV-3卵巢癌中的高表达与细胞侵袭有关，通过siRNA抑制MAP4K4的表达可抑制癌细胞的侵袭能力。

Hao等［6］在结直肠癌细胞系SW480中分离出不同侵袭潜能的单细胞克隆，并通过裸鼠皮下成瘤及原位种植瘤模型，筛选出高侵袭潜能克隆及低侵袭潜能克隆，经细胞划痕实验、细胞增殖实验及原位种植瘤实验验证，通过基因芯片技术比较高转移潜能克隆与低转移潜能单克隆细胞中差异表达的基因，通过层层筛选发现与结直肠癌转移密切相关的5个基因，MAP4K4是其中之一，随后作者通过免疫组织化学染色分析了该基因在181例石蜡包埋切片中的表达，在临床相关性分析中发现MAP4K4高表达与淋巴结转移及肿瘤浸润深度均显著相关。

卡波氏肉瘤疱疹病毒（KSHV）的溶菌性再活化在卡波氏肉瘤的发生、发展、侵袭和转移中发挥重要作用，一些激酶在病毒的再活化过程中起促进作用，Haas等［7］发现MAP4K4促进该病毒的溶菌性再活化，在感染KSHV（rKSHV.219）的靶细胞系（EA.hy 926或HuAR2T）中沉默靶基因后，KSHV对HEK293细胞感染力降低60%以上，并显著抑制KSHV溶菌蛋白的表达和染色体复制；血管内皮细胞HuAR2T感染KSHV并经病毒活化处理（顺序用丁酸钠及表达RTA的杆状病毒处理）后所具备的侵袭力可以被靶向干扰MAP4K4阻断，并显著抑制KSHV溶菌蛋白的表达。通过对活化处理的感染KSHV的内皮细胞HuAR2T进行MAP4K4沉默前后的转录谱对比，发现三个与肿瘤侵袭相关的基因PTGS2（编码环氧化酶2，COX-2）MMP7和MMP13（基质金属蛋白酶7和13）表达随MAP4K4沉默而显著下调。经qPCR及Western Blot验证，COX-2、MMP7及MMP13在感染KSHV的血管内皮细胞（HuAR2T rKSHV.219）中的表达经病毒活化处理后上调，但可被MAP4K4的靶向干扰阻断。说明MAP4K4通过上调PTGS2、MMP-7及MMP-9等侵袭相关基因的表达增强被感染内皮细胞的侵袭力。

富蛋氨酸酪氨酸激酶2（Pyk2，一种非受体酪氨酸激酶）在体外实验及种植瘤模型中被证明与神经胶质瘤的侵袭相关。Loftus等［8］在神经胶质细胞瘤细胞系SF767中通过酵母双杂交及免疫共沉淀发现MAP4K4可与Pyk2的N末端FERM区结合，并作为其底物。沉默MAP4K4可抑制细胞迁移，高表达MAP4K4可促进细胞迁移但可这种促迁移作用可被被沉默Pyk2阻断。说明MAP4K4与Pyk2的相互作用对神经胶质瘤的侵袭、迁移至关重要。

该基因在多种细胞系及一些种植瘤模型中的研究表明MAP4K4是一个促进肿瘤发生、侵袭的基因。

3 MAP4K4与肿瘤的临床相关性

Liang等［9］在胰腺癌中的研究发现66例胰腺癌标本中有30例（46%）MAP4K4表达过高，而从这66例胰腺癌病例获得的62例配对良性标本中，仅有12例（19%）有MAP4K4表达的增高（P=0.002，χ2检验）；MAP4K4-H组和MAP4K4-L组术后复发及远处转移频率有所不同，前者的复发及远处转移率占83%，而后者仅58%；MAP4K4的高表达也与肿瘤大小有关系（P=0.01，χ2检验）；虽然MAP4K4-H组和MAP4K4-L组的淋巴结转移频率无明显不同，但阳性淋巴结数目确有显著差异，前者阳性淋巴结数为（3.9±4.3）枚，后者为（1.5±1.8）枚（P=0.003）；同时对所有患者进行随访发现MAP4K4-H者预后较差，中位生存期为（19.5±2.9）个月，而MAP4K4-L的患者中位生存期为（65.2±19.4）个月，高水平的MAP4K4表达与这种低的生存期有关（P=0.02，Log-rank检验）；多变量分析结果提示，MAP4K4高表达与无复发生存和总生存差有关，MAP4K4是一个独立于年龄、肿瘤大小、分化程度和淋巴结状态的预后不良因子。

Liu等［10］研究了MAP4K4在肝细胞癌中的表达，发现MAP4K4在20例新鲜肝癌组织中的表达高于配对正常组织，并对400例石蜡包埋的肝癌组织标本进行免疫组织化学染色，分析该基因表达与各临床病理参数的关系，发现该基因高表达与肿瘤大小（P=0.006）、病理分级（P=0.001）、TNM分期（P=0.012）及肝内转移（P=0.002）显著相关（χ2检验）。通过Cox回归分析发现MAP4K4高表达是不良预后的独立预测因子（HR：2.98，95%CI：1.05～7.71，P=0.019）。在肝癌细胞系HepG2中通过RNA干扰沉默MAP4K4后，发现细胞增殖能力和侵袭能力减弱，细胞周期停滞于S期，凋亡增加。将MAP4K4基因沉默后HepG2在裸鼠体内种植瘤的生长受到明显抑制，该研究表明MAP4K4与肝癌的发生及进展密切相关。

Hao等［6］研究了与结直肠癌侵袭、转移相关的包括MAP4K4在内的5个基因在181例结直肠癌石蜡包埋切片中的表达，发现MAP4K4高表达与肿瘤分化程度（P=0.002）、Duke's分期（P=0.007）、淋巴结转移（P= 0.010）及肿瘤浸润深度（P=0.006）均显著相关（χ2检验）。MAP4K4表达在Log-rank单因素分析中与总生存率显著相关（P=0.029）

Qiu等［11］研究了MAP4K4在肺腺癌中的表达，发现MAP4K4在40例肺癌组织中的表达高于配对正常组织，并对309例石蜡包埋肺癌组织切片进行免疫组织化学染色，分析该基因表达与各临床病理参数的关系，发现该基因高表达与病理分级（P=0.027）、分期（P=0.048）、淋巴结阳性（P=0.006）及胸膜侵犯（P=0.024）显著相关（χ2检验）。通过Cox回归分析发现MAP4K4高表达是不良预后的独立预测因子（HR：2.83，95% CI：1.43～6.29，P=0.009）。

Zhao等［12］在胰腺癌细胞系中发现微小RNA-141（miR-141）可调控细胞增殖、侵袭、凋亡及化疗敏感性，显著影响皮下种植瘤的生长，miR-141在胰腺癌细胞系及胰腺癌组织中低表达，与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结及远处转移显著相关（卡方检验），并对胰腺癌的预后有显著影响（Cox回归分析）。而miR-141恰与MAP4K4的3'非翻译区（3'UTR）结合并负调控MAP4K4的表达，沉默MAP4K4同样导致细胞增殖、侵袭能力下降、凋亡增多、化疗敏感性增强。在种植瘤模型中高表达miR-141及沉默MAP4K4均可抑制种植瘤的生长，说明miR-141可能通过MAP4K4发挥作用。

MAP4K4在多种人体肿瘤中高表达，并且其高表达与临床预后显著相关，说明对该基因进行深入研究具有重要的临床意义。

4 MAP4K4在肿瘤中的可能作用机制

MAP4K4在肿瘤的发生和侵袭中起重要的调节作用，并与肿瘤的预后密切相关，但对于其具体信号传导通路仍不是很清楚。Collins等［5］认为MAP4K4是通过c-Jun N终端激酶（JNK1/2）起作用，而不是依赖Ap1的激活及其下游区的转录而促进细胞迁移和侵袭的发生。

Su等［13］最早发现MAP4K4作为接驳蛋白NCK的相互作用激酶（NCK interacting kinase，因此也被称为NIK）顺序激活MEKK1、MKK4和JNK。Tesz等［14］研究发现细胞因子TNFα通过TNF受体1（TNFR1）上调MAP4K4表达，并通过JNK1/JNK2和p38MAPK，作用于下游的转录因子c-JUN和活化转录因子2（ATF2）。Miled等［15］发现MAP4K4上有4个p53蛋白结合位点，当p53蛋白与该位点结合后可上调MAP4K4的mRNA表达2倍以上并激活JNK信号通路，通过siRNA沉默MAP4K4可以抑制p53诱导的凋亡，因此p53是通过MAP4K4调节JNK信号通路促进凋亡。

干细胞基因SOX2是凋亡抑制基因，在肿瘤发生中起关键作用，Chen等［16］在肺非小细胞肺癌细胞系A549研究中通过体外实验及原位种植瘤模型发现沉默SOX2可显著诱导细胞凋亡，并伴随TNFα、p53高表达及Ki-67抗原的低表达，同时意外发现MAP4K4在此过程中发挥了促凋亡作用。Aouadi等［17］在研究发现小鼠通过填喂β-1，3-D-葡聚糖包裹的MAP4K4靶向siRNA，通过沉默巨噬细胞的MAP4K4可抑制脂多糖诱导的TNF及白介素1释放引起的炎症反应。Liu等［10］在肝癌细胞系HepG2中沉默MAP4K4之后通过基因芯片检测了发生变化的MAP4K4下游基因，发现MAP4K4基因在肝细胞癌中通过NF-κB和JNK两条信号传导途径发挥作用（不是ERK也不是p38MAPK途径），而且MAP4K4靶向干扰后TLR5，TLR4，MyD88和TRAF6的蛋白表达也出现下调，说明在肝癌细胞多种与肿瘤进展相关的信号通路包括Toll受体信号通路、NF-κB和JNK信号通路均在MAP4K4的统一协调之下发挥作用。抗凋亡转录因子NF-κB可以激活与浸润转移相关的某些重要因子的表达，包括表皮生长因子（EGFR），基质金属蛋白酶（MMP），尿激酶型血纤维蛋白溶酶原激活剂（urokinase type plasminogen activator，uPA）和细胞黏附分子1（ICAM-1）等。与此研究结果相一致，Han等［18］同样在肝癌细胞系HepG2中沉默MAP4K4，发现沉默该基因之后MMP-2，MMP-9及NF-κB的表达明显下调，与之相对应的是细胞增殖、侵袭力均显著下降。

虽然多数研究结果显示MAP4K4下游的作用激酶是JNK，而JNK在多数研究中显示促凋亡活性，但也有研究显示JNK在肿瘤发生中起促进作用［19］，而且有作者指出JNK的亚型JNK1和JNK2的在肿瘤发生中起截然相反的作用［20］。JNK的作用底物最初为c-JUN，该底物被磷酸化后激活转录因子AP-1，目前一些新的JNK作用底物被发现如：ATF2，Myc，Elk1，SMAD3，NFAT4，p53，MADD，DPC4等。这些转录因子受到不同的刺激（如应激、细胞因子、生长因子）通过JNK信号通路被激活而调节不同的基因表达，导致炎症、细胞凋亡或肿瘤发生。

5 展望

MAP4K4在癌细胞系及癌组织中的表达，其对肿瘤细胞生物学行为的影响及临床相关性表明该基因是一个促肿瘤发生、侵袭和转移的基因，但在该基因是抗凋亡还是促凋亡问题上各研究结论不尽相同，随着对MAP4K4作用机制的深入研究，MAP4K4很可能成为肿瘤预防、治疗的新作用靶点。

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（2014-03-31收稿）

（2014-05-10修回）

（本文编辑：郑莉）

Progress of HGK research on tumors

Baojie MA,Yuanjie NIU
Correspondence to:Yuanjie NIU;E-mail:niuyuanjie9317@163.com

The Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin Institute of Urology,Tianjin 300211,China

This work was supported by Development Funds for Scientific Projects of Colleges and Universities in Tianjin(No.20120133)

HGK is a germinal center kinase(GCK)-Ⅳand is involved in controlling cellular processes,such as cell motility,cytoskeleton rearrangement,and cell proliferation.HGK is involved in a very complex network of signaling pathways and interactions involved in diseases,such as diabetes or cancer.HGK was determined to be highly overexpressed in different types of cancers,such as ovarian cancer,hepatocellular carcinoma,lung cancer,pancreatic cancer,and prostate cancer.Recent findings have shown that HGK is a novel target that may provide insight into new therapies to prevent or even treat many metabolic diseases,such as diabetes or even colon cancer,prostate cancer,breast cancer,ovarian cancer,pancreatic cancer,or hepatic cancer.

tumor,HPK/GCK-like kinase,signal transduction pathway

10.3969/j.issn.1000-8179.20140526

马宝杰 主治医师。研究方向为泌尿肿瘤外科。

天津医科大学第二医院，天津市泌尿外科研究所（天津市300211）

*本文课题受天津市高等学校科技发展基金计划项目（编号：20120133）资助

牛远杰 niuyuanjie9317@163.com

E-mail：scalpeltj@163.com