真菌耐药性及新型抗真菌药物研究进展

（江苏省无锡市第二人民医院，江苏 无锡214002）

20世纪80年代起，由于广谱抗生素的大量使用、HIV感染、癌症化学治疗和器官移植引起的免疫抑制患者增加等因素，真菌感染逐年上升[1]。同时随着抗真菌药物的大量使用，真菌的耐药率持续上升，影响了药物的治疗效果[2]。因此，了解真菌耐药性的发生机制及其耐药性的现状，对进行新型抗真菌药物的研究和开发具有十分重要的意义。抗真菌药物按结构类型大致分为唑类、多烯类、丙烯胺类、氟胞嘧啶类等，其中唑类药物应用最广泛。在此以唑类药物为重点，对抗真菌药物的耐药机制进行综述。

1 抗真菌药物的耐药机制

1.1 唑类抗真菌药物

近年来关于真菌对唑类药物的耐药机制研究比较多。目前多数学者认为其耐药机制主要有：唑类药物的靶酶14DM发生改变，包括基因突变导致靶酶与药物的亲和力降低，以及靶酶的过度表达[3]；耐药菌细胞膜上外排泵基因的过度表达[4]。

1)唑类药物的靶酶发生改变

目前已经克隆得到编码14DM的基因，并定为ERG11基因。ERG11基因的突变与过度表达均可使14DM结构发生改变，从而使药物的作用靶点改变。对唑类耐药的白色念珠菌菌株与敏感菌株进行ERG11基因的DNA测序，经比较可看出，在耐药菌中存在突变点（R467K），是467位的精氨酸置换成赖氨酸[5]。进一步研究提示，R467K突变可降低靶酶对氟康唑的亲和力而产生耐药性。在ERG11基因上存在另一个突变点T315A，将315位的苏氨酸置换成丙氨酸。这种特殊的突变直接发生在酶的活性部位，即在血红素的辅助因子上。Revankar有研究证实[6]，突变体的ERG11p酶的催化活性没有改变，但对唑类药物的亲和力下降，显示了靶酶基因ERG11发生突变与真菌的耐药有一定的相关性。靶酶基因的过度表达可产生大量的靶酶，细胞内药物的浓度不能完全抑制靶酶的活性，从而使真菌产生耐药性。Kudo等[7]的研究发现，在唑类耐药的光滑念珠菌中，其麦角固醇的含量增加，主要是由于14DM表达增多，也证实了ERG11基因过度表达与念珠菌耐药表型的关系。

2)耐药菌细胞膜外排泵基因过度表达

在念珠菌中，药物的外排泵出机制的改变是产生耐药性的重要机制。各种外排泵基因过度表达将细胞内的药物排出胞外，导致细胞内药物浓度降低从而不能有效抑制真菌的生长。主动外排系统包括2大类，一类是三磷酸腺苷(ATP)结合盒转运子家族（ATP Binding Cassette，ABC），如CDR基因；另一类是主要易化超家族（Ma—ior Facilitator Superfacilitater，MFS），如CaMDR及flul基因[8－9]。目前，至少有7个CDR基因已完成鉴定、测序，但体外试验结果显示，CDR1及CDR2基因与对唑类的耐药有关，其他的CDR基因与耐药性不相关。CDR1基因编码的跨膜蛋白，是一种ATP依赖性的转运子，可将小分子物质进行跨膜转运。Wada等[5]研究证实，CDR1基因与唑类的耐药性之间确实存在密切关系。在耐药念珠菌株中，CDR1基因的mRNA水平可增高5到8倍，说明CDR1基因在念珠菌产生对唑类药物获得性耐药中的重要作用。CDR2p其氨基酸序列有84%与CDR1p的氨基酸序列相同。CDR2基因的高表达也与对抗真菌药物的耐药性有关，但CDR2基因介导的耐药水平低于CDR1基因。

在白色念珠菌中，CaMDR1基因可编码MFS转运子，即可产生跨膜转运蛋白MDR1p，该蛋白的功能为利用氢离子的跨膜浓度差，逆向转运底物，使菌株表现出对药物的耐药性。在一些白色念珠菌耐药菌中，CaMDR1基因过度表达，而CDR1基因的表达水平维持正常，这提示CaMDR1表达增高与唑类耐药密切相关，并且CaMDR1对唑类药物具有选择性，CaMDR1基因的过度表达与氟康唑有关，而与酮康唑、伊曲康唑无关[10]。

真菌对唑类药物高度耐药是逐渐发展的，由几种耐药机制共同作用，最终导致真菌出现耐药表型。Calabrese等[11]对耐药白色念珠菌的流行病学调查发现，85%的耐药株为外排泵过度表达；35%的耐药株为药物靶酶的改变；75%的耐药株为多因素联合耐药。耐药表型的出现通常是多种因素共同作用的结果，而且菌株过长时间暴露于一种唑类药物中会导致不同唑类药物之间的交叉耐药。

1.2 多烯类抗真菌药物

多烯类药物的作用机制是直接与真菌细胞膜上的固醇类物质麦角甾醇相结合，在细胞膜上形成水性孔道，增加细胞膜的通透性，使菌体内重要物质外渗，最终引起细胞死亡。尽管多烯类药物在临床上应用30年，但其继发性耐药较少见，多局限于一些不常见的菌种，如洛西坦尼念珠菌、吉利蒙念珠菌等。现已发现，真菌对多烯类的耐药性与细胞内麦角甾醇的含量减少有关。细胞膜中缺少麦角甾醇的真菌变种常对多烯类药物有耐药性，其细胞膜中的主要甾醇成分已不是麦角甾醇。在对两性霉素B耐药的白色念珠菌突变体中，可发现麦角甾醇的含量有74%～85%的下降。进一步研究证实，在杜氏利什曼原虫中两性霉素B的耐药性，就是由于细胞膜中另外一种固醇替代了麦角甾醇，影响了细胞膜的流动性，并且改变后细胞膜对两性霉素B的亲和力较低[12]。

1.3 其他类抗真菌药物

丙烯胺类药物包括特比萘芬、萘替芬等，氟胞嘧啶类的代表药物为5－氟胞嘧啶，目前这些药物在临床上有一定的应用范围，耐药性产生情况也有进一步的研究。虽然特比萘芬的治疗失败已有报道，但由于药物的临床应用所引起的真菌获得性耐药尚未发现。然而，随着药物的广泛应用，耐药性的产生是不可避免的。Hsiao等[13]发现，一些对氟康唑耐药的光滑念珠菌表现出对特比萘芬的交叉耐药。而且，CDR基因的产物与特比萘芬之间存在着交互作用。另外，真菌细胞内药物含量下降，靶酶与药物的亲和力的下降都与耐药性的产生有关。丙烯胺类的耐药性机制已在一些酵母菌中发现，而在皮肤真菌中却没有检测到任何明显的耐药情况。目前，这类药物多用于浅表性真菌感染治疗。单独应用5－氟胞嘧啶抗真菌治疗时，有10%～15%的真菌可产生耐药性，目前其耐药机制正在进行广泛研究。对白色念珠菌的基因组学研究证实，氟胞嘧啶类的耐药性是由特殊菌株的基因型所决定的隐性特征，在菌株的遗传位点上存在着耐药基因FCY（FCY为显性，fcy为隐性）。因此，FCY/FCY菌株对氟胞嘧啶敏感，其尿嘧啶磷酸核苷转移酶（UPRT酶）活性高（大约为3U）；部分耐药的菌株表示出耐药基因的杂合子FCY/fcy，其UPRT酶活性减弱（大约为1.5U）；杂合子进一步突变将产生耐药表现型fcy/fcy，其UPRT酶几乎没有活性。基因分析已显示有两个基因定位FCY1和FCY2可以突变产生5－氟胞嘧啶耐药。

2 新型抗真菌药物

2.1 唑类药物的优化和开发

最近几年，唑类药物的衍生物已经发展成为一类具有极大发展潜力的抗真菌药物，现有超过15种新型唑类化合物正处于研究阶段，其中以伏立康唑（Voriconazole）为代表。体外试验表明，它对于念珠菌、新生隐球菌等都有良好的抑制活性；对一些霉菌如曲霉菌、镰刀菌、荚膜组织胞浆菌等也有抑制作用；但对接合菌无效[14－16]。

2.2 降低多烯类的毒副作用

多烯类药物其抗菌作用强，然而该药严重的副作用如中毒性肾损害和急性输入毒性等，使其临床应用受限。近年来，对两性霉素B的改良主要集中于对新剂型的设计，目前已有3种不同的脂质体剂型供临床使用，两性霉素B脂质体（L－AmB）、两性霉素B脂质复合物（ABLC）及两性霉素B胶体分散体（AB－CD）。目前，它们可用于难治性真菌感染或对两性霉素B不能耐受的真菌感染，也可用于中性粒细胞减少的发热患者的经验性治疗。

2.3 筛选新作用机制的抗真菌药物

将真菌细胞壁作为一个的抗真菌药物作用靶点设计合成半合成抗生素，其中较成功的是卡泊芬净（Caspofungin）等。卡泊芬净是第一个由美国食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗真菌感染的棘球白素类抗真菌药物。卡泊芬净对念珠菌、曲霉菌等有良好的抑制活性，对一些双性真菌如组织胞浆菌、粗球孢子菌、皮炎芽生菌等也有抑制作用。卡泊芬净已被批准用于治疗念珠菌感染和侵袭性曲霉菌病，尤其是对传统的抗真菌治疗无效或无法耐受的病例，已于2001年由Merck公司开发上市。除卡泊芬净外，还有很多种正处于研究开发中的棘球白素类药物，如Micafungin，Anidulafungin等，其抗真菌作用及作用机制与卡泊芬净相同，目前正进行Ⅲ期临床试验。此外，在抗真菌药物新作用机制的研发方面还有抑制几丁质合成酶的药物如Nikkomycin Z，作用于甘露聚糖蛋白物质的Pradimi－cin与Benaomicin等。

3 展望

抗真菌药物耐药性的发展已引起各国学者的高度重视，促进了抗真菌药物耐药性的深入研究。目前的研究一方面是进一步探讨抗真菌药物产生耐药的机制、传播方式、耐药性与临床治疗失败的关系，以及建立双相性真菌和霉菌的药敏实验方法，控制耐药性的发展；另一方面是加快开发新型抗真菌药物，以应对日益增多的耐药真菌。脂质型两性霉素B、新型唑类药物，以及棘球白素类抗真菌药物的问世，反映抗真菌药物研究正向高效、广谱、低毒的方向发展，为各种类型真菌感染的治疗提供新型的有力的手段。目前，抗真菌新药的开发方兴未艾，一些高科技手段如计算机辅助药物设计技术的应用将更加促进其创新性研究，相信不久的将来在抗真菌治疗方面一定会不断取得重大突破。

作者简介：赵文艳（1968－），女，主任药师，从事临床药学工作，（电子信箱）xyz3107＠sohu.com。

参考文献：

[1]张宇平，崔 健.1108株深部真菌医院感染耐药性分析[J].中华医院感染学杂志，2010（8）：1186－1187.

[2]蔡木禹，林朝仙，黄雯雯.卡泊芬净治疗重症监护患者侵袭性真菌感染对氟康唑无效/不能耐受的疗效分析[J].中国药房，2010（24）：2260－2262.

[3]顾觉奋，魏清筠.真菌耐药机制及新药研究动态[J].药学与临床研究，2010（3）：303－306.

[4]谢 宏，窦 娟，任芒格，等.热带假丝酵母菌外排泵基因与氟康唑耐药性的初步研究[J].中华临床医师杂志，2011（24）：7395－7398.

[5]Wada S，Nii mi M，Nii mi K，et al.Candida glabrata ATP－binding cassette transporters Cdrlp and Pdh1p expressedin aSaccharomyces cerevisiaestrain deficient in membrane transporters show phosporylation－De－pendent pumping properties[J].Journal of Biological Chemistry，2002，277（48）：46809－46821.

[6]Revankar SG，Fu J，Rinaldi MG，et al.Cloning and characterization of the lanosterol14α－demethy lase（ERG11）gene in Cryp tococcus neoform an s[J].Biochenical and Biophysical Research Communication，2004，324：719－728.

[7]Kudo M，Ohi M，Aoyama Y，et al.Effects of Y132H and F145L Substitutions on the Activity，Azole Resistance and Spectral Properties of Candida albicans Sterol 14－Demethylase P450 （CYP51）：A Live Example Showing the Selection of Altered P450 through Interaction with Environmental Compounds[J].J Biochem，2005，137：625－632.

[8]Piddock LJ.Clinically relevant chromosomally encoded multidrug resistance efflux pumps in bacteria[J].Clin Microbiol Rev，2006，19（2）：382－402.

[9]Kerr ID.Structure and association of ATP－bingding cassette transporter nucleotide－binding domains[J].Biochim Biophys Acta，2002，1561（1）：47－64.

[10]David SP.Resistance to echinocandin－class antifungal drugs[J].Drug Resistance Update，2007，10：121－130.

[11]Calabrese D，Bille J，Sanglard D.A novel multidrug efflux transporter gene of the major facilitator superfamily from Candida albicans （FLU1）conferring resistance to fl uconazole[J].Microbiology，2000，146（Pt11）：2743－2754.

[12]Nailis H，Vandenbosch D，Deforce D，et al.Transcriptional response to fluconazole and amphotericin B in Candida albicans biofi lms[J].Res Microbiol，2010，161（4）：284－292.

[13]Hsiao CR，Huang L，Bouchara JP，et al.Identification of medically important molds by all oligonucleotide assay[J].J Clin Microbiol，2005，43（8）：3760－3768.

[14]Walsh TJ，Raad I，Patterson TF，et al.Treatment of invasive aspergillosis with posaconazole in patients who are refractory to or intolerant of conventional therapy： an externally controlled trial[J].Clin Infect Dis，2007，44：2－12.

[15]Ullmann AJ，Lipton JH，Vesole DH，et al.Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft－versus－host disease[J].N Engl J Med，2007，356：335－347.

[16]Cornely OA，Maertens J，Winston DJ，et al.Posaconazole vs.fluconazole or itraconazole prophylaxis in patients with neutropenia[J].N Engl J Med，2007，356：348－359.