国内外肌萎缩性侧索硬化症发病相关蛋白研究进展

李 玲综述，黄银兰，马 腾审校

肌萎缩性侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一种选择性侵犯脑与脊髓的上、下运动神经元的神经系统变性疾病，临床特点为全身进行性肌无力、肌肉萎缩、肌束震颤，多数患者将在出现临床症状后3～5 y 内死于呼吸肌麻痹。5%～10%肌萎缩侧索硬化症病例为家族性肌萎缩侧索硬化(FALS)，FALS 表现为常染色体显性遗传或常染色体隐性遗传。目前将FALS 分为12 个亚型:ALS1～ALS8、合并ALS 的额颞叶痴呆综合征、X 性连锁遗传的ALS、关岛型ALS-Parkinson-痴呆综合征、进行性下运动神经元疾病等。其中ALS1、ALS3 及ALS4 型为常染色体显性遗传，而ALS2 及ALS5 型为常染色体隐性遗传，ALS6 少见，以常染色体显性遗传为主，偶有常染色体隐性遗传。FALS 的基因定位尚未完全明了，只有ALS1 型确定是由于铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)基因突变所致，其约占FALS 的15%～20%［1，2］，ALS2 其致病基因定位于2q33，与Alsin 基因的突变有关;ALS3 致病基因位点目前尚不明确;ALS4 其致病基因定位于9q34，与Senataxin 基因的突变有关;ALS5 其致病基因定位于15q15-q21，具体尚不清;ALS6 其致病基因与FUS/TLS 有关［3］;ALS7 其致病基因定位于20ptel-p13［4］;ALS8 与囊泡相关膜蛋白有关［5］。目前该病的发病机制仍然不明确，主要的假说理论有:环境理论、肌萎缩侧索硬化的遗传变异、自由基理论、免疫理论、神经生长因子缺乏理论、神经元蛋白及神经微丝的新陈代谢异常、兴奋性氨基酸毒性理论、内质网应激理论等。种种致病机制理论都显示运用分子生物学相关知识进行论证的重要性，现笔者将从该疾病目前国内外研究其发病的相关蛋白质进行一综述。

1 铜-锌超氧化物歧化酶(SOD1)及其相关蛋白

研究证实约5%的SALS 和20%的FALS 都与SOD1 基因突变有关。SOD1 基因位于21q22，长11 kb，编码区459 bp，5 个外显子，编码153 个氨基酸，组成32kD 的Cu/Zn SOD蛋白，分布于细胞胞浆内。SOD1 是一种抗氧化酶，能催化O2转化为H2O2，维持细胞内活性氧内稳态的平衡，以达到解毒的目的。大量研究表明FALS 中20%的病例是由超氧化物歧化酶(superoxidedismutase 1，SOD1)发生氨基酸突变引起的，但作用机制尚不明确［6］。SOD1 发生突变，与锌的结合力下降、Cu/Zn SOD 蛋白稳定性下降有关，引起线粒体空泡化和膨胀，导致对运动神经元的毒性作用。SOD1 基因突变会产生过量的自由基，从而造成神经损伤。而且研究发现蛋白质聚集和包涵体存在于所有的ALS 患者中［7］。而且实验者们通过大量对SOD1 G93A 转基因小鼠的研究都说明SOD1 突变可以促进神经元的损伤。

国内研究人员胡俊［8］等，通过对重庆地区一家系ALS 患者进行家系成员Northern 杂交实验，发现该ALS 家系为SOD1 的2 号外显子编码区的插入突变，是一种新的SOD1 基因突变类型，引起氨基酸种类和数量上的改变，严重影响了2号外显子编码的亚单位的生理活性，导致突变SOD1 蛋白的抗氧化损伤能力降低，最终导致神经元损伤。而卢锡林［9］等对中国南方4 个家系15 例FALS 患者和56 例SALS 患者、46例正常对照，采用SOD1 基因的5 对引物，DNA 进行PCR 扩增，重复3 次应用单链构象多态性方法分析各外显子的多态性，发现SOD1 基因的5 个外显子未出现异常波动，从而猜想中国南方人群ALS 患者可能不存在SOD1 基因第1-5 号外显子突变或突变率极低，可能存在其他位点的基因突变。刘佳骏［10］等通过收集全部已知SOD1 氨基酸错义突变106 个，运用3 种生物信息学方法和工具进行预测结果基本一致，共有39 个对蛋白质聚集有促进作用的突变，占所有突变的37%，从而得出氨基酸突变导致蛋白质聚集并非是导致ALS 发病的唯一途径，蛋白质聚集只是ALS 发病过程中的诱因之一。梁秀岭［11］等在2 个家系中发现6 例SOD1 活性下降，3 例MDA 含量增高，进一步表明红细胞内Cu/Zn SOD 活性测定及MDA 含量测定有可能作为ALS 1 型患者及基因携带者的诊断方法之一，并可用于FALS 初步分型及基因检测前的筛查。这一结果有可能使ALS 的患病率有所下降，并且证实壮族正常人与汉族正常人Cu/Zn SOD 活性和MDA 含量均无显著性差异，但笔者认为该项对比不能显示壮族患病或携带者与汉族患病或携带者之间也同样无显著性差异，还有待进一步证实。大量的研究还表明在突变的SOD1 相关的ALS 患者、细胞以及动物模型中，线粒体的损伤参与了发病机制过程，能否认为线粒体的损伤参与了所有的ALS 患者发病?这还需要广大科研工作者们的进一步的研究证实。

2 TAR DNA 结合蛋白-43(TDP-43)

Neumann［12］等在ALS 和伴有泛素阳性包涵体的额颞叶痴呆患者［front otempor allobardementia with ubiquitin-positive inclusions(FTLD-U)］，的神经细胞和神经胶质细胞的胞浆中发现了泛素化的包涵体，其中TDP-43 是主要的组成成分。TDP-43，它是普遍存在的核蛋白，由414 个氨基酸组成。它是由1 号染色体上的TARDBP 基因编码的。它的作用包括了特异性前RNA 的剪切和转录，信使RNA 的稳定性以及小RNA 的生物发生等。至今，已在散发和遗传性的ALS 患者的TDP-43 基因中发现40 多种的显性突变，TDP-43 的发现为我们研究ALS 发病机制开拓了新的视野。但也有研究表明所有的散发性肌萎缩侧索硬化症(SALS)患者中有TDP-43在神经元细胞中异常聚集，但在SOD1 相关的FALS 患者中没有出现［13］。因此普遍认为，TDP-43 蛋白异常主要与散发性肌萎缩侧索硬化发生相关。另外，Chio［14］等发现5%SALS患者TARDBP 基因突变导致细胞中有TDP-43 异常聚集，在欧洲人群中28.7%的ALS 与TARDBP 基因突变有关;在萨丁尼亚人群中40%的SALS 与TARDBP 基因突变有关，猜测他们可能有一个共同的祖先。但在亚洲人群中目前还没有统计到底有多少家族性或散发性ALS 与TARDBP 基因突变有关。最近有研究证明突变SOD1 蛋白和TDP-43 相互作用，这一作用可能与ALS 的发病有关［15］，还需大量实验验证。

3 瘤融合/脂肪肉瘤转运蛋白(FUS/TLS)

FUS/TLS 是一种由526 个氨基酸组成的蛋白质，基因位于16 号染色体16q12，由15 个外显子编码，功能上与TARDBP 基因相关。在2009 年，Kwiatkowski 等［16］在家族性ALS患者中发现了13 种FUS/TLS 基因突变，位于家族性ALS 的16 号染色体上。研究表明家族性和散发性ALS 与FUS 基因突变相关，其中ALS6 含有FUS 蛋白的细胞内包涵体［3］，但国内目前尚无相关报道。

4 内质网上相关蛋白

目前国内外对ALS 患者及实验动物的研究已经初步证实内质网应激与ALS 的发病机制相关。内质网上有3 种跨膜蛋白，分别为IRE1、ATF6 和PERK。当IRE1 活化产生核酸内切酶活性，对其下游XBP1 的前体mRNA 进行剪接，编码sXBP1 蛋白，而活化的ATF6 被转移到高尔基体水解形成活化的p50-ATF6，而sXBP1、p50-ATF6 通过进入细胞核，诱导内质网相关基因的表达，从而促进错误蛋白的正确折叠。PERK 通路在内质网应激发生后，发生自身磷酸化，进而磷酸化转录起始因子eIF2α，使细胞中广泛的蛋白正常翻译下调，当细胞中发生过度的内质网应激，则可使细胞凋亡，最终导致疾病发生。Yvonne［17］等发现浆膜蛋白-4A 伴蛋白质二硫化物异构酶(protein disulfide isomerase，PDI)可以保护ALS 小鼠减少神经退化，说明这是一个潜在的治疗ALS 的一条途径。

5 中间丝蛋白

中间丝蛋白包括神经丝蛋白NF、a 丝联蛋白或外周蛋白。肌萎缩侧索硬化中运动神经元损坏的特征就是神经微丝的堆积，神经微丝是维持正常的神经结构和状态的主要蛋白质，属于Ⅳ中间丝，分别由低分子量(NF-L，68kDa)、中分子量(NF-M，160kDa)和高分子量(NF-H，200 kDa)3 种多肽亚单位组成。编码人类NF-L 和NF-M 基因紧密相连，均位于8 号染色体8P21，NF-H 基因位于22 号染色体22Q12.2，分别由543 个、916 个、1020 个氨基酸组成。有研究表明将老鼠的神经微丝蛋白质结构完全改变或表达过量，就会导致类似肌萎缩侧索硬化的表现。据报道［18］TDP-43 通过与3’UTR 的直接相互作用，稳定了低分子量hNFL 的mRNA 的表达，稳定性的改变与ALS 中NF 聚集体的形成有关。Robertson［19］等在SOD1 G37R 转基因小鼠中检测出表达外周蛋白的毒性剪接变异体per61，这个证据表明在ALS 中可以找到表达的神经毒素的剪接的变异体。而Xiao［20］等在ALS 患者中发现外周蛋白Per28，Per28 与疾病病理学相关，其3 号外显子编码一种终止密码子使外周蛋白截短为28 KDa。Per28可以诱导外周蛋白包涵体形成可直接诱导疾病发生。

6 神经生长因子、血管生成因子

神经营养因子对人类运动神经的生长和维持起重要的作用，对患有各种运动神经损害的老鼠有延长运动神经生存的作用。已有动物实验证明，神经营养因子能够减慢肌萎缩侧索硬化的发展。目前能够使运动神经细胞再生的新型神经生长因子还在继续研究，例如:胰岛素样神经营养因子(IGF-1)、睫状神经营养因子、脑源性神经生长因子(BDNF)等。Angelo［21］有效的神经保护因子，包括似胰岛素样神经营养因子-1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)，可以最大化的运动神经元传导速度，为了得到高表达的脊髓IGF-1，研究人员将腺病毒群编码的人类IGF-1 注入SOD1 G93A 小鼠的腰髓实质中，研究人员可以观察到健康的和长期的椎管内IGF-1 表达，及对腰椎脊髓运动神经元的保护，延迟了疾病的发作，增加了动物的生存时间，为ALS 的治疗带来希望。血管生成因子(angiogenin，ANG)，胰核糖核酸酶A 超中14.1 kDa大小的蛋白成员，在运动神经元的胞浆和胞核内表达。在欧洲和北美种群中已确定ANG 基因突变与家族性和散发性肌萎缩侧索硬化症相关;而亚洲ALS 人群有没有ANG 突变至今还没有报道。血管生成因子ANG 与其结合元件结合可增强核糖体RNA 转录，可调节血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)的表达，而且据报道VEGF 缺失的转基因小鼠具有进行性运动神经元病的表现。可见VEGF是运动神经元变性的改性剂，存在一定的治疗潜力。然而邹漳钰［22］等对中国ALS 患者，10 个家族性ALS 患者，202 个散发性ALS 患者和151 例健康对照者进行筛查，在散发性ALS患者中发现了一种新的错义突变，c.379G＞A(p.V103I)，ANG 突变占所有ALS 患者中的0.5%，认为不同种群之间存在差异，ANG 突变可能参与中国汉族人群ALS 的发病。

7 肌纤维中Nogo-A 蛋白

Nogo 是一种基因编码3 种蛋白质:Nogo A、Nogo B、Nogo C。到目前为止，科研工作者已经证实它能够抑制成熟的中枢神经系统神经元轴突再生及诱导细胞凋亡的作用。Yvonne［17］等发现Nogo A 蛋白突变可加速SOD1 G93A 转基因小鼠的运动神经元变性。国内学者孙阿萍［23］等对40 例明确诊断的ALS 患者肌肉冰冻组织标本行Nogo A 免疫组织化学染色实验，得出Nogo A 蛋白在ALS 患者和其他疾病所致的萎缩肌肉中都表达，所以Nogo A 蛋白的表达不能作为诊断ALS 的标准。国内外研究者之所以出现不同的结论，笔者猜想可能是国外采用转基因小鼠实验不一定能全全代表ALS 患者，毕竟人和小鼠结构组织上还是有差异的，再者可能与患者所居住的环境、国内外所选用实验仪器不同等有关。

8 相关氨基酸蛋白

神经系统兴奋性氨基酸异常，特别是谷氨酸盐，过量的谷氨酸盐能直接破坏运动神经细胞。Vianello［24］等在ALS小鼠与神经元细胞中caspase-1 基因被抑制的caspase-1 突变基因小鼠杂交实验中首次证明了半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶caspases 在神经退行性疾病中的作用。另有研究表明SOD1 基因突变和caspase-1 基因突变都表达的小鼠比只表达SOD1 突变体基因的小鼠生存期延长9%以上，并且减慢疾病发展速度50% 以上。Muller［25］等的实验还证明caspases 抑制剂Z-VAD-FMK 对ALS 小鼠进行治疗caspases-1、3 的转录上调均被推迟。Kilic［26］等在ALS 模型小鼠的脊髓样品中也发现了caspases-1、3 的激活，由此说明caspases抑制剂可以作为另一种ALS 的治疗途径。

9 其他蛋白

Pasinetti 等［27］采用表面增强激光解吸a 电离飞行时间质谱蛋白质组学技术对ALS 患者、疾病对照者(其他神经系统疾病患者)以及正常对照者的CSF 进行分析，发现ALS 患者CSF 中有3 类蛋白，分子量分别为4.8、6.7、13.4(kDa)，可以将ALS 患者与其他疾病患者鉴别开，其诊断的精确性为95%、敏感性为91%、特异性为97%。其中4.8 kDa 蛋白为神经分泌蛋白VGF 蛋白酶片段，13.4 kDa 蛋白为胱氨酸蛋白酶抑制剂C。这3 种蛋白可以作为ALS 的附加诊断的生物学标记物，为ALS 早期诊断提供更加可靠依据，从而延缓ALS 患者的生存时间，为治疗提供更多可能。动力蛋白激活蛋白(dynactin)，在德国Munch［28］等对142 个SALS 患者，应用单核苷酸多态性分析，确定出3 个动力蛋白激活蛋白的突变亚型，T1249I、M571T、R785W。还有视神经蛋白OPTN、UBQLN2、S100、线粒体中的细胞色素氧化酶1(eyelooxygenasel，COXI)基因缺陷、14-3-3 蛋白等都有文献报道与ALS 发病相关。

10 结语

导致肌萎缩侧索硬化症最基础的病因可能是基因突变，但最终的原因应该是蛋白质的表达异常。其致病机制假说很多，大多研究者都是从单一的一种假说进行论证，但不能将其验证到所有的ALS 患者身上，所以笔者认为是否能将几种假说联系起来，通过几种假说发现一种共同的致病机制，寻找相应的确切的致病蛋白，从而为ALS 的诊断及其治疗提供可靠依据。

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