TLR4在心血管疾病中的研究进展

张丽楠 张邢炜

●综 述

TLR4在心血管疾病中的研究进展

张丽楠 张邢炜

心血管疾病是包括心肌及血管疾病的总称，是威胁人类健康的重大疾病类别之一。不断深入的研究发现，大部分心血管疾病的发生、发展都有免疫反应的参与。TOLL样受体4（TLR4）作为天然免疫受体家族——TOLL样受体（TLRs）家族的成员之一，与许多疾病的发生、发展密切相关，成为当前的研究热点。本文对TLR4在部分心血管疾病的发生、发展过程中的作用及其机制的相关研究进展予以综述。

1 TLRs家族

机体的免疫机制主要包括天然免疫和后天免疫。天然免疫是在个体出生时即具备，作用范围广泛，不针对特定抗原的免疫能力，所以也称非特异性免疫。天然免疫在机体防御机制中具有重要作用，是抵抗病原微生物感染的第一道防线，因此天然免疫曾一度被人们认为是机体对外界刺激的一种低等应答。然而随着对免疫机制研究的不断深入，天然免疫的重要性日益凸显。TLRs家族既是先天性免疫应答中重要的跨膜受体和信号转导受体，也是触发先天免疫和获得性免疫应答的关键分子，目前成为研究的热点。人TLRs最早发现于1997年，后为之命名为TLR4。随着研究的不断进展，迄今为止，在人体中至少已经发现了11个TLRs家族成员，分别为TLR1～TLR10、TLR14，它们主要表达于免疫相关细胞，包括单核细胞、树突状细胞，也可见于成纤维细胞、肥大细胞和多种组织器官（肾小管、呼吸道、心脏等）的上皮细胞；在亚细胞结构，人TLRs主要分为表达于细胞膜的TLR1、TLR2、TLR4～6、TLR11和表达于线粒体内的TLR3、TLR7～9两大类[1]。TLRs主要包括富含亮氨酸的重复序列（LRR）的胞外区、富含半胱氨酸结构域的穿膜区以及TOLL/IL-1R同源结构的胞内区3部分。正是这种特殊结构使其识别的信号易于进一步转导，同时也意味着任意区域的缺失突变都会导致信号转导的异常。

研究发现，TLRs是一类广泛分布于细胞表面的跨膜蛋白，属于表面模式识别受体（PRR），因其与成员的胞外区的同源性略有差异，因此可以识别多种不同的内源性及外源性配体[2]。包括通过识别病原相关分子模式（PAMPs）[3]来激活固有性免疫系统的肽聚糖（PGN）、细菌脂蛋白、合成的聚肌胞苷酸poly、鞭毛蛋白、病毒单链RNA（ssRNA）等，也包括通过损伤相关分子模式（DAMPs）[4]识别的热休克蛋白（HSP）、细胞外基质的降解产物、自身的核酸成分等。TLRs的信号转导特点与炎症和免疫反应有关，TLRs识别受体后，可传递给细胞内的接头分子髓样分化蛋白88（MyD88）、MyD88转接样蛋白（Mal）和TRIF相关的接头分子（TRAM）。这些分子可以通过激活炎症的主要调节物核转录因子κB（NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）和β干扰素（IFN-β），引起多种细胞因子释放，上调抗原提呈细胞（APCs）、表面CD80（B7-1）、CD86（B7-2）等共刺激分子，并最终激活特异性免疫系统，产生细胞保护作用[5]。

2 TLR4

TLR4是TLRs中最先被发现的成员，因其在炎症反应、肿瘤、心血管疾病、自身免疫的发生、发展中扮演了重要的角色，已成为免疫机制研究中的热点。TLR4主要表达于细胞膜，属于Ⅰ型跨膜蛋白，位于9q32-33，其cDNA长度约为3811bp，包含879个氨基酸。同家族中其他成员一样，TLR4也由三个部分组成：胞外区是由24个富含亮氨酸的重复序列组成；胞内区约含有200个氨基酸残基，由TOLL同源结构域和分子羧基端长短不同的短尾肽组成，该区域是TLR4与其下游相关的信号转导分子，如MyD88、IL-1相关蛋白激酶（IRAK）、肿瘤坏死因子受体活化因子6（TRAF-6）和蛋白激酶等相互作用的关键部位；跨膜区具体组成尚不明确。TLR4在人体内分布范围广泛，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、肥大细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞、小肠上皮细胞、呼吸道上皮细胞、表皮微血管、脐静脉内皮细胞、人成牙龈纤维细胞、子宫平滑肌细胞、心肌细胞等。TLR4除以革兰阴性细菌的细胞壁成分内毒素（LPS）为主要配体外，还可识别包括紫杉醇、呼吸道合胞体病毒蛋白F（RSF）、HSP60、假单胞菌属LPS等[6]。

3 TLR4介导信号通路

TLRs信号转导通路在免疫调节中发挥重要作用，根据信号传递过程分为细胞外传递和细胞内传递。细胞外传递主要是通过内毒素结合蛋白（LBP）将LPS从细菌外膜上转移下来,并与其脂质A结合，通过形成LPSLBP复合物，与可溶性CD14（sCD14）结合，并形成由这3者构成的复合物。将复合物中的LPS传递给膜结合CD14（mCD14），再由mCD14将LPS传递给TLR4。Akira等[7]研究表明LPS结合MD-2后,通过TLR4的细胞外富含亮氨酸的重复结构介导TLR4的聚合,从而诱导TLR4完成细胞外信号转导。同时,LBP和CD14将LPS交给高密度脂蛋白颗粒,促进其清除。细胞内途径则依据早期有无MyD88参与分为MyD88依赖性信号转导通路和MyD88非依赖性信号转导通路。两条通路最终都激活NF-κB，以诱导靶基因（主要是炎性细胞因子、化学趋化因子）的转录、翻译，使炎性细胞因子大量表达，导致机体组织、器官的损害。MyD88依赖性通路主要介导炎性细胞因子产生；MyD88非依赖性通路主要促进LPS诱导的IFN诱导性蛋白-10、糖皮质激素终止反应基因-16、INF调节基因-1（INF-1）的表达和树突状细胞成熟[8]。

3.1 MyD88依赖性信号转导路径 MyD88分子质量为35kU，具有两个特殊的结构区域，即N端死亡域和C端TIR结构域。通过TIR结构域与TLR4发生关联、通过DD结构域与IRAK发生关联。同时当MyD88被募集到TLR4后,通过TIR和DD结构域形成同源二聚体。因此MyD88的功能是作为转接蛋白连接TLR4和其下游含有DD结构域的信号分子。MyD88介导的信号转导过程是在完成细胞外转导后，诱导TLR-4/MD2异二聚化，使MyD88和MAL聚集到TLR4受体复合体。IRAK-1和IRAK4与该受体复合物结合后，首先引起IRAK-4的磷酸化，随后为IRAK-1磷酸化，使其从受体复合体上解离，并与TRAF-6相互作用，从而诱导AP21转录因子的激活或进一步使转录因子NF-κB迁移到细胞核内，引起相关基因的转录。通过上述信号转导途径, TLR4介导转录因子的活化,诱导靶基因的转录,介导早期的天然免疫反应。

3.2 MyD88非依赖性信号转导路径 随着研究的不断深入，Akira等[7]首先发现TLR4的信号转导不只有MyD88依赖性通路,还存在MyD88非依赖通路。MyD88同源蛋白是含TIR结构域的衔接蛋白（TIRAP），又称Ma l，包括含TLR样受体相关的干扰素活化子（TRIF），含TIR结构域的接头分子-1（TICAM-1）及TRA，由这些蛋白介导了MyD88非依赖性信号转导通路。MyD88非依赖性通路主要是通过活化干扰素调节因子3（IRF3）和NF-κB来释放INF-1和各种炎症因子。TRIF通过TRAF3激活催化IRF3的磷酸化和诱导其核异位，而激活后的IRF3能诱导INF1的表达，且能促使各型干扰素的基因表达；同时TRIF通过TRAF6和受体相互作用蛋白1（RIP1），激活转化生长因子激活激酶（TAK1），通过与MyO88依赖性通路类似的途径激活NF-κB和MAPKs，最终促使炎性细胞因子的产生和释放。

4 TLR4与心血管疾病

心血管疾病为临床常见病种，自1990年以来持续成为我国居民首位死亡原因，根据2006年和2008年卫生部卫生统计信息中心发布的数据，我国心血管病病死率分别为183.7/10万和241.0/10万，占当年死亡构成比的34.8%和40.27%，病死率有逐年增高趋势[9]。不断深入的研究发现，动脉粥样硬化、高血压等非感染性心血管疾病的发生、发展均与氧化应激和炎症反应有着密切关系。TLR4在动脉粥样硬化、高血压、心力衰竭、心肌炎等心血管疾病的发生、发展过程中发挥了重要作用。

4.1 TLR4与动脉粥样硬化 动脉粥样硬化是与多种危险因素如高血压、糖尿病、吸烟等相关的动脉慢性炎症性疾病，多种因素在其发生、发展过程中起重要作用。动脉粥样硬化最早表现为血管内皮细胞功能障碍，导致血管壁完整性被破坏[10]。而血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞的损伤以及树突状细胞、单核巨噬细胞等免疫细胞分泌炎症因子与TLR特别是TLR2和TLR4密切相关，在动脉粥样斑块的形成和发展中发挥重要作用。人类动脉粥样硬化斑块表面高度表达TLR1、TLR2、TLR4及激活的NF-κB[11]。TLR表达水平的增加引起细胞激活和促炎症级联反应的激活。Michelsen等研究发现，TLR4/ApoE双敲除的小鼠比ApoE敲除的小鼠动脉粥样硬化的发生率低，且内膜损伤程度也低于MyD88/ ApoE双敲除的小鼠。但在TLR4/ApoE和MyD88/ApoE双敲除的小鼠中，其抗动脉粥样硬化的作用与胆固醇水平无明显相关性。同时，在TLR4/ApoE和MyD88/ApoE双敲除的小鼠动脉粥样硬化斑块中的脂质和巨噬细胞也显著降低，这说明TLR4信号通路在动脉粥样斑块的发生、发展中和斑块稳定性中起着至关重要的作用。正常情况下TLR4在人主动脉内皮上表达很少，然而在动脉粥样硬化早期，TLR4表达水平即明显增高。He等[12]研究发现，LPS通过调节TLR4信号通路引起内皮祖细胞（EPCs）增殖，维持其干细胞表型，并参与动脉粥样硬化早期损伤修复。动脉粥样硬化血管壁的中膜平滑肌细胞中TLR4表达增加，参与调节平滑肌的增殖，而血管平滑肌细胞（VSMCs）在调节血管厚度，与新内膜的形成过程中发挥重要作用。随着病变进展，大多数沉积的脂类来自于血浆中的低密度脂蛋白（LDL），它们利用内皮损伤或功能失常而进入血管壁。Midwood等[13]在动脉粥样硬化斑块中发现TLR4配体结合腕蛋白C。Cole等[14]在动物模型研究中指出，轻度修饰的低密度脂蛋白（mmLDL）是一种促进具有致动脉粥样硬化潜力的促炎症因子与趋化因子分泌的强烈诱导剂，作为内源性配体可激活TLR4信号途径，加速动脉粥样硬化病变的发展。Hayashi等[15]在研究中发现，感染牙龈卟啉单胞菌的TLR4/ApoE双敲除的小鼠较单纯ApoE缺陷小鼠更易形成动脉粥样硬化，通过活体成像技术可以发现随着年龄的增长病变发生及进展逐步增强，证明了TLR4在慢性炎症与动脉粥样硬化的进展中起到重要的作用。Lu[16]通过使用TLR4拮抗剂球形红杆菌脂多糖作用于糖尿病ApoE缺陷小鼠和非糖尿病ApoE缺陷小鼠，发现TLR4拮抗剂可以抑制糖尿病ApoE缺陷小鼠血管炎症及动脉粥样硬化进展，亦可降低非糖尿病ApoE缺陷小鼠血清胆固醇及甘油三酯水平。因此，在血脂代谢紊乱和慢性炎症相互作用下，TLR4在动脉粥样硬化发生、发展中可能起着重要的桥梁作用。

4.2 TLR4与高血压 高血压是常见的心血管疾病，其发生和发展是其靶器官如心脏、肾脏、血管的结构和功能的损伤过程，对于高血压的发生机制，除遗传、精神、神经作用外还包括血管、体液调节等因素的影响。肾素-血管紧张素-醛固酮系统平衡失调即为高血压发生的重要因素之一，血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是该系统中的重要活化部分，而AngⅡ本身不仅是一种促炎症介质，还可作为一种内在的氧化剂，促使氧化应激的发生。康晓敏等[17]将野生型C57小鼠随机分为对照组、AngⅡ组和TLR4组。对AngⅡ组小鼠进行TLR4中和抗体注射。结果显示与对照组比较，AngⅡ组小鼠血压及部分相关炎症指标表达明显下调，与AngⅡ组比较，TLR4组小鼠血压及部分相关炎症指标表达明显下调，进一步说明TLR4通过介导炎性反应参与AngⅡ所致高血压小鼠血管重构。从而为TLR4参与AngⅡ所致的高血压小鼠血管重构提供了直接的证据。Marketou等[18]通过将43例非糖尿病高血压患者随机分为降压标准治疗组与强化治疗组，并将16例正常人设为正常对照组，分别比较治疗前后各组TLR4基因在外周血单核细胞表达情况，研究显示，进行治疗前高血压患者的TLR4 mRNA水平明显高于正常对照组。治疗12周后，与标准治疗组相比，强化治疗组TLR4 mRNA表达水平显著下调。由此亦可以推断，TLR4与高血压存在相关性。

4.3 TLR4与心力衰竭 几乎所有的心血管疾病发展到终末阶段都会导致心力衰竭，而且心力衰竭的发生往往不是单一病因所致，更重要的是有多种神经体液因子参与。感染作为心力衰竭的首要诱因，明确了炎症与心力衰竭的相关性。1990年首次提出了心力衰竭与炎症的关系，陈颖等[19]将90例老年慢性左心衰竭患者与健康对照者外周血EMP62E、TLR2、TLR4水平比较，老年慢性左心衰竭患者3者表达均增高，且与患者心力衰竭程度呈正相关。而对于TLR4促使心力衰竭发展的机制考虑氧化应激激活内皮表面附着的中性粒细胞,释放炎性蛋白S-100A12并与内皮细胞表面晚期糖基化终末产物受体相互作用,通过MAPKs和NF-κB信号通路，导致内皮细胞损伤[20]。而TLR4可促使NF-κB表达,活化NF-κB信号通路,导致心肌缺血和心肌细胞收缩功能失调。同时TLR4信号转导通路还可通过共同的下游衔接蛋白MyD88，导致内皮损害更加严重,使老年慢性左心衰竭进一步恶化。Ogawa等[21]将小鼠的左冠状动脉结扎，造成急性大面积心肌梗死和慢性心力衰竭模型，检测相关指标发现，心力衰竭小鼠脑干相对于假手术组TLR4的表达明显增高。以上研究均可说明，TLR4及其介导产生的炎性因子在慢性心力衰竭的进展过程中起着重要作用。

4.4 TLR4与心肌炎 心肌炎是各种感染、免疫介导损伤以及中毒等所引起的心肌细胞炎症过程。病毒性心肌炎（VMC）是我国最常见的心肌炎，随着病情的进展，有一部分可发展为扩张型心肌病（DCM）。在呼吸道合胞病毒、柯萨奇病毒导致的病毒性心肌炎中，一系列炎性因子是由TLR4介导产生的，TLR4通过增加病毒复制以及影响细胞因子的产生，加重心肌炎症、引起心肌细胞肥厚和坏死，从而影响VMC和DCM的发生、发展和预后。Li等[22]在通过柯萨奇病毒B3感染正常Balb/c小鼠过程中发现，随时间推移模型组心脏组织病理评分明显高于对照组，模型组心肌胶原容积分数在28d显著高于对照组在各个时间点并高于本组7d和14d时间点。在各时间点,模型组的肥大细胞数量及TLR4的表达与对照组相比显著增高，且心脏肥大细胞数量与TLR4mRNA表达在所有时间点呈正相关。由此推断肥大细胞和TLR4在VMC的炎症反应和纤维化过程中扮演了重要角色。DingY等[23]用柯萨奇病毒B3建立病毒性心肌炎小鼠模型，并用肉桂油进行干预，发现干预小鼠的死亡率、心肌iNOS、TNF-α、NF-κB p65和TLR4的表达较模型组低，并指出肉桂醛在治疗病毒性心肌炎重要通过其代谢产物肉桂酸抑制TLR4-NF-κB信号通路。周欣等[24]指出通过抑制TLR4mRNA及NF-κB在病毒性心肌炎中的表达，减轻心肌损伤。在VMC后期心肌成纤维细胞的数目增多，而成纤维细胞表面也有TLR4的表达，可以认为是VMC后期TLR4增加原因之一[25]。Ehrentraut等[26]研究发现，应用TLR4拮抗剂可通过减少炎症因子以及增加抗炎细胞因子，控制心肌肥厚的进展，减轻心肌肥厚。Jenke等[27]发现在免疫性心肌炎中通过抑制TLR4信号通路可有效地减缓心肌免疫细胞活动，延缓炎症进展。虽然TLR4信号通路在心肌炎中起重要作用，但有关其在心肌炎中的作用的研究结果不尽一致，近年也有研究报道脂多糖诱导激活TLR4，可减少心肌细胞凋亡，从而改善存活心肌细胞功能。因此对于更详尽的机制有待更加深入研究。

综上所述，TLR4作为晚近发现的免疫反应中关键分子的TLRs家族成员，在部分心血管疾病的发生、发展过程中发挥了重要作用。随着研究的不断深入，TLR4很可能成为心血管疾病防治的新的靶点。虽然人们对TLR4已经有较为全面和深入的认识,但其在某些疾病中的作用机制仍有待进一步阐明。随着科技的不断进步，研究的不断深入，以及针对TLR4为靶点的药物与疫苗的研制、开发，TLR4在心血管疾病的临床诊断治疗及判断预后等方面都将取得突破性的进展。

[1] Aalaei-Andabili S H,Rezaei N.Toll like receptor(TLR)-induced differential expression of microRNAs(MiRs)promotes proper immune response against infections:A systematic review[J].Infect, 2013,67(4):251-264.

[2] Steinhagen F,Kinjo T,Bode C,et al.TLR-based immune adjuvants[J].Vaccine,2011,29(17):3341-3355.

[3] Harberts E,Gaspari A A.TLR signaling and DNA repair:are they associated[J]?Invest Dermatol,2013,133(2):296-302.

[4]Piccinini A M,Midwood K S.DAMPening inflammation by modulating TLR signalling[J].Mediators Inflamm,Epub 2010 Jul13.

[5] 韩正强,王楠楠.Toll样受体的研究进[J].畜牧与兽医,2011,43(12): 93-96.

[6]Lucas K,Maes M.Role ofthe TollLike Receptor(TLR)RadicalCycle in Chronic Inflammation:Possible Treatments Targeting the TLR4 Pathway[J].MolNeurobiol,2013,48(1):190-204.

[7] Akira S,Takeda K.Toll-like receptor signalling[J].Nat Rev Immunol,2004,4(7):499-511.

[8] Watts C,West M A,Zaru R.TLR signalling regulated antigen presentation in dendritic cells[J].Curr Opin Immunol,2010,22(1):124-130.

[9]中国医师协会心血管内科医师分会.心血管疾病一级预防中国专家共识[J].中华内科杂志,2010,49(2):174-185.

[10] Tuttolomondo A,DiRaimondo D,Pecoraro R,et al.Atherosclerosis as an inflammatory disease[J].Curr Pharm Des,2012,18(28): 4266-4288.

[11] 许逸飞,朱敏,蔡宏文,等.Toll样受体与动脉粥样硬化研究的现状和进展[J].心电与循环,2013,32(5):419-422.

[12] He J,Xiao Z,Chen X,et al.The expression of functional Toll-like receptor 4 is associated with proliferation and maintenance of stem cellphenotype in endothelialprogenitor cells(EPCs)[J].Cell Biochem,2010,111(1):179-186.

[13] Midwood K,Sacre S,Piccinini A M,et al.Tenascin-C is an endogenous activator of Toll-like receptor 4 that is essential for maintaining inflammation in arthritic joint disease[J].Nat Med, 2009,15(7):774-780.

[14] Cole J E,Mitra A T,Monaco C.Treating atherosclerosis:the potentialof Toll-like receptors as therapeutic targets[J].Expert Rev Cardiovasc Ther,2010,8(11):1619-1635.

[15] HayashiC,Papadopoulos G,Gudino C V,et al.Protective role for TLR4 signaling in atherosclerosis progression as revealed by infection with a common oralpathogen[J].Immunol,2012,189(7): 3681-3688.

[16] Lu Z,Zhang X,Li Y,et al.TLR4 antagonist reduces early-stage atherosclerosis in diabetic apolipoprotein E-deficient mice[J]. Endocrinol,2013,216(1):61-71.

[17]康晓敏,吕宏娟,王霞,等.Toll样受体4在血管紧张素Ⅱ所致高血压小鼠血管重构中的作用[J].中华老年心脑血管病杂志,2013,15(1):67-70.

[18]Marketou M E,KontarakiJ E,Zacharis E A,et al.TLR2 and TLR4 gene expression in peripheralmonocytes in nondiabetic hypertensive patients:the effect of intensive blood pressure-lowering [J].Clin Hypertens(Greenwich),2012,14(5):330-335.

[19]陈颖,李峡,郭燕.老年慢性左心衰严重程度与循环EMP62E和Toll样受体水平变化的关系[J].实用临床医药杂志,2011,15(24):10-12.

[20]Vince R V,Chrismas B,Midgley AW,et al.Hypoxia mediated release of endothelial microparticles and increased association of S100A12 with circulating neutrophils[J].Oxid Med Cell Longev, 2009,2(1):2-6.

[21] Ogawa K,Hirooka Y,Kishi T,et al.Brain AT1 receptor activates the sympathetic nervous system through toll-like receptor 4 in mice with heart failure[J].Cardiovasc Pharmacol,2011,58(5): 543-549.

[22]李辉,黄林枫,文纯,等.心脏肥大细胞及Toll样受体4在小鼠病毒性心肌炎中的作用[J].中国当代儿科杂志，2013,15(10):896-902.

[23] Ding Y,Qiu L,Zhao G,et al.Influence of cinnamaldehyde on viralmyocarditis in mice[J].Am J Med Sci,2010,340(2):114-120.

[24]周欣,刘春梅,胡安娜,等.黄芪甲苷对病毒性心肌炎小鼠TLR4、NF-κB及TNF-α表达的影响[J].中华临床医师杂志,2012,6(13): 3659-3662.

[25] Fukui A,Ohta K,Nishi H,et al.Interleukin-8 and CXCL10 expressions in oral keratinocytes and fibroblasts via Toll-like receptors[J].MicrobiolImmunol,2013,57(3):198-206.

[26] Ehrentraut H,Weber C,Ehrentraut S,et al.The toll-like receptor 4-antagonist eritoran reduces murine cardiac hypertrophy[J]. Eur J Heart Fail,2011,13(6):602-610.

[27] Jenke A,Wilk S,Poller W,et al.Adiponectin protects against Toll-like receptor 4-mediated cardiac inflammation and injury [J].Cardiovasc Res,2013,99(3):422-431.

2013-09-16）

（本文编辑：马雯娜）

310015 杭州师范大学附属医院心内科

张邢炜，E-mail：xwzhang@medmail.com.cn