社区获得性肺炎非典型病原体的诊断方法进展

童春堂 陈杭薇

社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia, CAP)是指在医院外罹患的肺实质感染性(含肺泡壁，即广义上的肺间质)炎症, 包括具有明确潜伏期的病原体感染，在入院后潜伏期内发病的肺炎[1]。CAP严重威胁人类健康, 在世界不同的国家和地区有较高的发病率。引起CAP的主要病原体有细菌、病毒以及非典型病原体等，其中仍以肺炎链球菌和流感嗜血杆菌为代表的细菌较常见[2]。近年来随着人口老龄化、病原谱改变、检测方法的改进及抗生素滥用等原因，肺炎链球菌的感染率有所下降, 而非典型病原体及病毒的感染率在逐年上升[3]，因而在 CAP 的诊治方面除考虑细菌感染外，还需警惕包括肺炎支原体(mycoplasma pneumonia, MP)、肺炎衣原体(chlamydia pneumonia, CP)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila, LP)等在内的非典型病原体所致CAP的可能，现就近年来引起CAP的非典型病原体诊断方法的进展综述如下。

一、非典型病原体在CAP中的地位

CAP的病原体主要有细菌、病毒以及非典型病原体，其中非典型病原体主要有MP、CP、LP等。以往认为年轻CAP患者容易感染非典型病原体，但近年来的研究表明老年人中亦有一定比例的MP、LP、CP感染，且常常是混合感染[4]。过去因认识不足及检测方法的限制，非典型病原体在CAP中的作用被低估，随着对呼吸道非典型病原体研究的深入，人们逐渐重视到其在呼吸道感染中的地位。2003年12月至2004年11月刘又宁等[5]对665例CAP患者进行的多中心病原学流行病学调查，同时进行细菌与非典型病原体检测的610例患者中，53.1%(324例)检测到病原体，其中MP、CP、LP阳性率为32.3%，MP阳性率为20.7%(126例)，超过肺炎链球菌的10.3%(63例)，成为导致CAP最常见的病原体，2项及以上病原体混合感染率为11.5% (70例)，其中以细菌合并非典型病原体居多, 尤其是肺炎链球菌合并MP感染，195例细菌培养阳性患者中10.2%(62例 )合并非典型病原体的感染。2007年进行的一项全球CAP病原学调查分析结果显示非典型病原体在北美、拉美、欧洲和亚非的发病率分别为28%、21%、22%和20%[1]。尤兰华等[6]在2013年1月6日至2013年1月15日对北京周边军营中403名出现咳嗽、咳痰、咽痛、鼻塞、流涕等呼吸道症状的新兵中进行的一项呼吸道病毒及非典型病原体IgM抗体调查结果显示，MP、LP抗体阳性率分别为13.9 % (56例)、 6.0%(24例)，2项及以上病原体IgM抗体混合阳性率为5.5%(22例)，其中以MP合并LP最为常见。一些学者认为包括MP、LP等在内的呼吸道非典型病原体将来有可能取代肺炎链球菌成为引起CAP最重要的病原体[7]。

二、 CAP中非典型病原体的诊断

1.MP的诊断： MP是介于细菌和病毒之间的一种病原微生物，可引起气管炎、支气管炎、肺炎等, 并导致多种肺内外并发症，是引起CAP的常见病原微生物。一般起病隐匿，感染后潜伏期为2～3周，临床症状缺乏特异性，常有发热、咳嗽，可伴头痛、乏力、肌痛等全身中毒症状[8]。血常规白细胞总数和中性粒细胞比例大多正常[9]，胸部X线表现为肺门部位模糊影，也可呈大片实变影，多累及上肺，病变吸收缓慢[10]，目前实验室诊断方法主要有分离培养、血清学检测和分子生物学方法等。

(1)分离培养法：MP的分离培养特异性高，是诊断MP感染的最为可靠的方法，但生长缓慢，对营养基要求较高，一般选取鼻咽拭子、痰液标本接种于液体或半固体培养基中。目前以SP-4肉汤培养基应用最为广泛，此种方法敏感性低，特异性却很高[11]。此法存在部分患者干咳不易获取标本、标本采集过程中易污染、培养时间长、操作复杂、费用高等不足，难以满足临床快速早期病原诊断的要求，一般不作为临床检测方法，多用于科研[12]。 Thurman等[12]研制的MP快速液体培养基，通过采集鼻咽拭子，利用MP的代谢产物分解葡萄糖产酸使培养基中pH值降低，通过指示剂颜色改变来间接判断是否有MP的增殖，24～48 h内观察结果，该方法简单、快速、无需特殊设备，适合临床实验室诊断MP的感染[13]，其特异性在排除细菌或真菌等导致的假阳性后可达到与血清学一致的水平[14]。

(2)血清学：血清学检测是诊断MP感染的常规方法[15]，包括对抗原和抗体的检测，目前临床上多检测MP的特异性IgM和IgG抗体。IgM一般在机体感染后7～10 d出现，是机体感染MP后最早出现的抗体。3～6周达到高峰后逐渐下降，血清中检出IgM抗体常提示新近感染，而IgG抗体在机体感染后出现较晚，但存在时间长，其浓度峰值出现在机体感染MP后的第5周[16]。急性感染的诊断标准为急性期IgG抗体与间隔2～4周测定的恢复期IgG抗体滴度存在4倍及以上升高[17]，血清学常用的方法包括冷凝集试验、补体结合试验(complement fixation test, CFT)、间接血凝试验(indirect hemagglutination test, IHA)、间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence, IFA)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)等。其中①冷凝集试验：机体感染MP后发生非特异反应产生冷凝集素，主要是IgM抗体，因严重贫血、流感病毒及腺病毒感染等也会造成实验阳性结果，其特异性较低，但因其技术操作简单，在部分单位仍作为诊断MP感染的重要方法；②CFT：机体感染MP后7～8 d补体结合抗体开始上升,主要检测特异性IgM抗体，初次感染时结果阳性，再次感染时常常呈阴性[18]，因此阴性不能排除MP感染，且需要专业人员、操作复杂，不适于临床常规检测；③间接血凝试验：基于红细胞表面的抗体(或抗原)与相应抗原(或抗体)结合使红细胞集聚发生凝集的原理，主要检测IgM抗体，操作简便、快速，但是因其与生殖道支原体及LP存在交叉反应，限制了其在临床的推广应用[19]；④IFA: 可定性检测MP的特异性IgM抗体，具有较高的敏感性和特异性,操作简便、不需特殊仪器、人员要求低，适合临床实验室MP检测的要求，能够为临床提供早期诊治的病原依据，是诸多快速检测方法中值得推荐的一种技术[20]；⑤ELISA：是目前应用最广泛的血清学方法，可同时检测MP特异性IgM和IgG抗体。有报道称其检测成人IgM灵敏性可达82%[12]，临床中可联合检测IgM 和IgG抗体以提高诊断灵敏度，该方法快速、简便、特异性高，但灵敏感度低、费用高。

(3)分子生物学法：主要包括核酸杂交技术和聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)，以后者应用更为广泛。自Benmet于1989年首次将PCR技术应用于MP的诊断[21]，PCR技术已不断发展与成熟。PCR法对标本的要求低，标本来源可以为鼻咽拭子、痰液、胸腔积液等，即使标本中存在微量的病原体，也能得到阳性的结果，其检测MP的DNA敏感性及特异性均较好[18]。采用特异标记的探针的实时荧光定量PCR技术，在MP感染早期、血清学检测结果阴性时亦能获得阳性结果，适合2岁以下儿童感染患者[22]。荧光定量聚合酶链反应(fluorescence quantitative polymerase chain reaction, FQ-PCR) 可直接检测标本中的MP抗原，且MP-PCR拷贝数越大越支持MP感染的诊断[23]。但PCR法操作技术复杂、人员素质要求高、设备昂贵，一般实验室不易普及。

2.CP的诊断

CP为严格的细胞内寄生微生物，主要通过呼吸道传播，人群普遍易感，其潜伏期为1～3个月，临床表现不典型，常出现咳嗽、发热、咽喉疼痛、声音嘶哑等，可引起、支气管炎、肺炎等[24]，胸部X线多表现为单侧的片状阴影和网状浸润影[25]。CP感染与动脉粥样硬化、冠心病、心肌梗死也有一定关系[26-27]，病原体检测方法主要有分离培养、血清学和PCR法。

(1)分离培养法：CP只能生长繁殖于活细胞内，分离培养方法是诊断CP感染最可靠的方法，标本可采用鼻咽拭子、胸腔积液或痰液，但操作复杂、耗时长，不能为临床诊治提供早期快速的病原依据。

(2)血清学方法：CP感染潜伏期为1～3个月，机体多于感染CP后2～4周产生IgM抗体， IgG抗体产生则在第6～8周，通过测定IgG和IgM 抗体可区分急性和既往感染[28]。血清学方法包括CFT、ELISA、直接免疫荧光法(direct immunofluorescence, DIF)、间接微量免疫荧光法(micro-IF, MIF)等。其中:①CFT：因部分患者重复感染CP时可不出现补体结合抗体，导致补体结合试验阳性率低，限制其应用；②ELISA：基于酶标记的ELISA可同时检测CP的IgM、IgG、IgA 抗体，该方法简便、快速，适于大样本筛查, 但与某些细菌存在交叉抗体反应；③DIF：以荧光标记的抗CP单克隆抗体检测其抗原，CP与其他衣原体属、微生物如百日咳杆菌、大肠埃希杆菌等有交叉抗原成分，实验结果假阳性率高，灵敏性及特异性低；④MIF是目前应用最广泛的血清学方法，是将待检的标本滴加在已知的抗原或抗体平板上，再加入荧光色素标记的抗人球蛋白，于荧光显微镜下观察的方法。该法敏感性高于直接荧光法，特异性高、操作简便、无需特殊仪器，是检测感染经典的金标准法[29]。

(3)PCR法：PCR方法于1992 年首次用于CP的诊断，根据CP特异性的抗原或基因片断进行检测, 能直接反映是否有活性的CP病原体存在[30]，其诊断CP感染敏感性和特异性均较高, 阳性提示即时感染[31]。其中FQ-PCR检测CP具有特异性高、准确定量、降低交叉污染等优点，对CP感染早期诊断有重要意义[32]。PCR方法取材方便、无创伤易被接受，敏感性和特异性相对较高，值得在临床应用和推广，不足的是操作要求高，且不同实验室采用不同的引物，无标准化，尚未得到普遍认可。

3.LP的诊断

LP是引起呼吸道感染的主要非典型病原体之一，在1976年美国费城退伍军人中首次被发现并命名。LP广泛存在于自然界和空调、冷却塔、淋浴器等供水系统中，机体可因吸入被LP污染的水源产生的气溶胶感染[33]。目前已知16个血清型，其中LP1型是CAP最常见的病原体[34]，潜伏期为2～10 d，临床症状主要有刺激性咳嗽、发热、头痛及全身不适等，易造成多器官损害，胸部X线可呈斑片、结节状改变或间质浸润影[35]。 其检测方法主要有分离培养、PCR法、抗体和抗原检测。

(1)分离培养：该方法为LP临床诊断及流行病调查的金标准，但LP对生长条件要求苛刻，生长缓慢，一般3～7 d培养出阳性结果，有时甚至10 d以上[36]，而且不能在普通培养基中生长。目前较多采用BCYE及在其基础上加入抗生素组合GVPC制成的选择性培养基，标本可取自供水系统、痰液、胸水、气管灌洗液等，亦有用细胞培养和阿米巴培养检测LP的报道[37]。分离培养作为检测LP的金标准特异性高，对LP致病机制、毒力、耐药发生、分型等研究意义重大，还可以为临床确诊提供病原证据，但敏感性低、价格昂贵、培养周期长，不适于临床快速诊断。

(2)PCR法：自1989年Starnbach等[38]首次采用PCR检测出水中LP的DNA后，PCR法已能够检测出已知的LP所有血清分型。PCR法可对环境中的水样及临床感染患者的鼻咽拭子、尿液、胸水、痰液等进行DNA检测，常用的PCR引物有军团菌属的特异性引物5S rRNA、16S rRNA基因、mip基因及染色体引物LEG[39]，而且在LP感染早期将mip基因作为引物联合尿抗原法较单独采用PCR法检测确诊率高11%[40]。PCR法无论在临床病原诊断，还是环境标本检测中均有一定的优势，但操作复杂、仪器昂贵，多在科研及商业中应用。近年来在常规PCR技术基础上，先后发展的套式PCR、半套式PCR、多重PCR、巢式PCR、 real-time PCR等技术则更适用于临床实验室检测，而且通过减少产物污染、避免交叉反应、降低假阳性结果进一步提高了灵敏度和特异度。随着PCR技术的发展，其在临床快速诊断中的应用将越来越受到欢迎。

(3)LP抗体检测：作为诊断LP感染的传统方法，仍被众多实验室采用。患者感染LP后约1周产生特异性IgM抗体，而特异性IgM抗体第二周左右可检测到，IgM抗体虽然出现晚，但体内存在时间长，可以作为回顾性诊断的依据[41]。进行病原诊断时，因单次血清结果无法区分新近感染还是既往感染，需采集急性期和恢复期双份血清，检测方法包括IFA、微量凝集法 (micro- agglutination, MAA)、ELISA等。以IFA、ELISA应用最为普遍，其中IFA最早用于LP抗体的检测，可以在感染初期检测到LP特异性IgM 抗体。MAA无需特殊仪器，能检测特异性IgM 抗体，检测方便、价格低廉，适于基层单位LP的早期诊断[42]。ELISA可检测特异性IgG抗体，已发展成自动检测法，结果准确、客观，文献报道其敏感度高于IFA和MAA[43]，被越来越多的实验室采用，但多用于回顾性诊断和流行病学调查，而不是LP的早期诊断中。因机体感染LP后产生特异性抗体存在窗口期，过早行急性期或恢复期抗体检测可能会出现假阴性结果。另外部分健康人存在隐性感染的可能， 相关研究表明LP抗体在33%的患者感染2年后仍可检出[36]，因而血清学检测不适合作为LP感染的早期诊断方法，故LP抗原检测已成为应用较广泛的方法。

(4)LP抗原检测：LP抗原检测方法快速、简便、廉价，可以为临床提供早期、快速的病原诊断，敏感性及特异性较好，可作为临床实验室诊断LP的常规方法。常用的有EIA、放射免疫法(radioimmunoassay, RIA)、免疫层析法(immunochromatography, ICT)、直接荧光抗体法(direct fluorescent antibody, DFA)等，以ICT应用最为广泛，是针对LP1的抗原快速检测方法，已制作成商品化的试剂盒。其中天津瑞爱金生物科技有限公司采用胶体金免疫层析法(gold immunchromatographic assay，GICA)，基于抗原抗体反应的LP抗原检定卡，15min便可读取检测结果，能够对病情的早期诊断提供有力证据[44]，有一定的特异性和敏感性[45]，其不足的是仅能检测常见的LP1型。

非典型病原体是CAP的重要病原体，可以造成各年龄段的人群感染致病。目前检测非典型病原体的方法很多，单靠一种方法诊断病原菌仍比较困难，分离培养法过去作为“金标准”，因技术操作复杂、耗时长、阳性率低等缺点不适合临床应用。近年来随着免疫标记技术的发展，其所具有快速、简便、适合大样本筛查等优点，能为疾病的及时诊治提供有力的病原证据，更适合临床需求，但对于呼吸道非典型病原体的诊断，临床上可采取联合应用两种以上方法检测以增加敏感度。

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