间充质干细胞成软骨分化诱导相关细胞因子的研究进展

蒋超 吴志宏 邱贵兴 王以朋

（中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院骨科，北京 100730）

间充质干细胞成软骨分化诱导相关细胞因子的研究进展

蒋超 吴志宏 邱贵兴 王以朋*

（中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院骨科，北京 100730）

软骨的破坏、缺损是包括骨关节炎（osteoarthritis，OA）在内的多种骨科疾病的重要病理改变。由于软骨特殊的解剖及组织特性，如缺乏血管和淋巴管的分布，使得其自我修复能力异常不足，因此通过人工方法修复软骨破坏具有重要临床意义。近年来，随 着 间充 质干细 胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的发现和研究的深入，其来源广泛、良好的增殖能力、多分化潜能、与各种3D支架材料具有良好的生物相容性等特性[1-5]，使得其在软骨修复应用中具有令人期待的潜力。除了从骨髓中获取该细胞，目前已经从人体多种组织分离、获得了此类细胞，如脂肪、关节液、骨膜、胎盘组织、肝、脾、胰腺等[6-8]。有文献报道，MSCs不具有免疫原性[9]，甚至可能通过调节免疫细胞功能，起到免疫抑制作用[10-12]。此外，各种成软骨分化刺激因子的发现、应用及各种3D支架的探索，使得MSCs结合各种技术在软骨修复的临床应用中显示出极大的可能价值。

生长因子作为成软骨分化培养基不可缺少的部分，吸引了众多学者的关注。其在MSCs成软骨分化过程中起到的作用随着不同的生长因子、使用浓度、MSCs的来源和细胞状态等条件的变化而变化。目前研究较多的生长因子包括转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF），成纤维生长因子（fibroblast growth factor，FGF），骨 形 态 发 生 蛋 白 家 族（bone morphohenic proteins，属于 TGF-β超家族）等 。此外，其他生物因子如地塞米松、抗坏血酸等[13]已被证实为成软骨分化培养基的基本添加剂，在此不再详细讨论。

1 TGF-β

TGF-β家族通过与受体异质性复合体（receptor heteromeric complex）的 相 互 作 用，激活 R-Smad 蛋白。后者与 Co-Smad 联合，此激活的复合体随后被转入细胞核，调控相关基因的表达从而参与调节MSCs的增殖、分化和细胞外基质（ECM）的合成。TGF-β被认为与地塞米松同时作为成软骨分化培养基的必要成分[14]。已有大量研究表明，微量的 TGF-β即可使蛋白聚糖（proteoglycan）和Ⅱ型胶原的合成明显增加[15]，TGF-β促进 MSCs成软骨分化的细胞数量增加，且提高其生存能力[16]。体外研究证实，TGF-β可以使成软骨分化早期相关基因 SOX-9的表达水平升高[17]；同时伴随着软骨细胞外基质Ⅱ型胶原的基因表达水平上升，而Ⅱ型胶原是透明质酸软骨合成的重要生物标志物；另一软骨细胞细胞外基质成分聚蛋白聚糖（aggrecan）的表达也具有类似的改变；而成骨相关基因Ⅰ型胶原的表达水平则进一步明显下降，由此显示TGF-β的另一作用即保持MSCs诱导而来的软骨细胞透明质酸软骨表型[18]。在作用时间方面，TGF-β主要作用于成软骨分化早、中期，因此有学者认为，TGF-β不需要在诱导全程添加[19]，但考虑到其具有保持软骨细胞处于肥大增殖前状态[20]，故推测其可能对MSCs成软骨分化全程具有重要作用。

尽管有学者认为 TGF-β2 及 TGF-β3 的促软骨分化能力可能比 TGF-β1 更有势[21]，但多数认为 TGF-β的促软骨分化能力与其亚型无关。目前研究表明，在单层平面诱导培养时，MSCs成软骨分化效率与TGF-β的浓度和培养时间有关，而在立体培养环境中，10 ng/ml的 TGF-β浓度足以顺利地促进 MSCs成软骨分化[21,22]。

然而，鉴于TGF-β可能需要参与成软骨分化诱导全程，且其在体内的运输、代谢较体外实验更加复杂，故目前用于体内实验需要一个合适的缓释体系，以避免反复的关节腔内注射带来的痛苦和关节腔感染等严重并发症。

2 BMPs

大部分BMPs属于TGF-β超家族，通过影响软骨祖细胞定性和分化，在骨形态发生过程中起到重要作用，故命名“骨形态发生蛋白”。BMPs通过胞膜上相关受体作用，促发Smads通路相关信号传导级联反应，从而增强骨与软骨的发生发育[23]。临床上已明确某些骨骼系统发育相关疾病的发生与BMPs的基因突变有关，比如软骨发育不良；而在动物实验中，BMPs 缺乏也使得动物出现骨骼系统缺陷[24]。研究表明 BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7 与 TGF-β在诱导MSCs成软骨分化过程中具有协同作用，但是单独的BMPs在常规微球法诱导过程中却无法有效促进MSCs成软骨分化，提示其促成软骨分化作用依赖于其他细胞因子的存在[25]。此外，不同来源的 MSCs 其成软骨分化过程中对BMPs的依赖程度也不一样：Richter等[21]曾报道骨髓来源的 MSCs其成软骨分化诱导不依赖于 BMPs，而脂肪和关节滑液来源的MSCs成软骨分化过程则需要BMP-6的参与。

在BMPs家族中，BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-13、BMP-14已被证实在体外具有诱导MSCs成软骨分化作用。BMP-7可加速软骨细胞重塑，在动物（兔子）实验中用于修复软骨全层缺损；而联合微骨折处理能增强 BMP-7 修复软骨全层缺损[26]。BMP-2、BMP-4、BMP-6 促进Ⅱ型胶原转录水平，诱导 MSCs成 软 骨 分 化[27,28]。 目 前 对 于 不 同 亚 型 BMPs 诱 导MSCs成软骨分化能力大小仍存在争议，此前有文献通过比较不同亚型BMPs诱导组微球大小、重量、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达水平，认为 BMP-2 促进骨髓来源 MSCs成软骨分化能力要优于 BMP-4、BMP-6[29]。

尽管有大量文献支持BMPs具有单独促进MSCs成软骨分化能力或与其他因子如TGF-β协同作用，但大部分BMPs同时具有诱导成骨的作用。BMPs异位骨形成是需要继续研究和克服的一个重要问题，尤其在关节腔内异位骨形成的后果更加严重。Hannallah 等[30]的研究 认 为 Noggin（BMP 拮抗剂）可 能 抑制BMP-4引起的异位骨化作用。

3 FGF

成纤维生长因子（FGF），又称肝素结合生长因子（heparin binding growth factor）在人体内有多种异构体，其广泛参与维持对包括骨骼系统、消化系统、血液系统、心血管系统在内的多个系统的正常结构和功能。FGF作用于络氨酸激酶FGF受体（FGFRs），从而激活 PI3 激酶、MARKs、Src、ERK 和 p38 等信号通路及因子[31]。FGF 基因缺陷与包括软骨发育不良、骨关节炎等多个骨科相关疾病的发生有关。

FGF-2 和 FGF-18 在维持软骨基质动态平衡中起到重要作用。添加 FGF-2 因子可以促进 MSCs增殖加快，同时诱导其成软骨分化；钙离子依赖性信号通路调控 FGF-18 的表达，后者促进 MSCs分化的同时抑制其增殖[32]。在 Cucchiarini等[33]的研究中，他们通过重组腺病毒介导FGF-2基因转染，实现了软骨细胞对兔膝关节软骨缺损区的修复。

目前关于FGF-2与其他诱导软骨分化的细胞因子的联合作用仍然存在争议[34-37]。文献报道 FGF-2 和TGF-β1的联合作用可以在体外实验中加快细胞增殖和 新 软 骨 的 形 成[34]；在 异 体 移 植 模 型 中 ，FGF-2 与IGF-1 共转染促进软骨修复过程[35]。然而，FGF-2 与BMP-6联合作用则会抑制后者的成软骨分化诱导能力[36]；亦有文献认为 FGF-2 会抑制 TGF-β，减弱后者在鼠来源 MSCs的诱导成软骨分化能力[29]。由此看来，尽管FGF参与软骨形成和MSCs成软骨分化过程，但其与其他细胞因子间的相互作用需要进一步研究，以明确其用于体内外MSCs成软骨分化过程的用法和用量。

4 IGF

胰岛素样生长因子（IGF）家族包括两种多肽（IGF-1 和 IGF-2）、两 种 特 异 性 受 体（IGF1R 和IGF2R）、六种结合蛋白（IGFBPs）以及 IGFBP 蛋白酶构成。IGF-1与IGF1R结合后激活多条通路，参与人体多部位组织的同化作用，促进纤维软骨细胞的增生以及透明质酸软骨的成熟[38,39]，在人及动物中均发现 IGF-1 基因突变与严重的骨骼发育迟滞相关[40]。

有关IGF促软骨形成的体外动物实验研究表明，IGF能显著提高聚蛋白聚糖、Ⅱ型胶原和黏多糖等软骨细胞外基质主要成分的合成[41,42]；将 IGF-1 与Ⅱ型胶原复合物填充于软骨缺损区，可显著增加软骨修复的效率和质量[43]。Fukumoto 等[44]的研究表明，IGF-1 可以显著提高 MSCs的成软骨分化程度，且 IGF-1 与TGF-β具有协同作用，两者合用较单独添加 IGF-1 或TGF-β1 能最大程度提高 MSCs细胞增殖和成软骨分化程度。当 MSCs单独受TGF-β3刺激时候，其分化过程中Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原蛋白的基因表达水平同时升高，但是当同时受 TGF-β3 和 IGF-1 作用时，MSCs分化过程中Ⅰ型胶原的表达水平明显下降，而Ⅱ型胶原的表达水平升高。类似的实验结果同样出现在 BMPs和 TGF-β合用时。而在 Indrawattana 等[45]的实验中，实验人员通过体外微球法诱导骨髓MSCs成软骨分化，研究包括 TGF-β、BMP-6、IGF-1 在内的三种生长因子对MSCs成软骨分化的相互作用。他们的研究结果认为骨髓MSCs可以很好地成软骨分化，而 IGF-1或 BMP-6与 TGF-β3 联合作用，可以更好的促进MSCs的成软骨分化。由此认为生长因子的联合作用可能是MSCs体外成软骨分化的关键。

5 展望

本文归纳总结了近几年国内外对促进MSCs成软骨分化相关生长因子的研究现状，目前已经明确包括TGF-β、BMPs、FGF、IFG等在内的多个生长因子参与MSCs在体内外的成软骨分化过程。各生长因子的单独作用和相应机制已经研究比较深入，但对于其相互之间的作用和作用方式仍需要未来进一步的研究，以期获得促进MSCs成软骨分化的生长因子最佳组合；此外新的、更有效的促进MSCs成软骨分化的生长因子仍需要被研究发现，以进一步提高MSCs在体内外成软骨分化的效率和质量。

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*通信作者：王以朋，E-mail:jiangchao2189@sina.com