绵羊可食性组织中盐酸克伦特罗残留规律的研究

■刘 萌苏晓鸥张 瑜 王国春

(1.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京100081；2.辽宁省朝阳市朝牧种畜场，辽宁朝阳122000)

盐酸克伦特罗 (Clenbuterol hydrochloride，CL)是一种人工合成的β-肾上腺受体激动剂。由于盐酸克伦特罗可减少脂肪沉积、增加肌肉生成，曾经被用作生长促进剂在动物生产上使用。但是盐酸克伦特罗可能会在动物体内形成积累性残留，人食用含有盐酸克伦特罗残留的动物性食品后，会出现急性中毒症状，如过敏、恶心、呕吐、心率失常、高血压等。猪(Smith，2000)、牛（Girault，1990）、马（Hagedorn，1995）、鸡（Malucelli，1994）等动物体内盐酸克伦特罗代谢残留已有研究，在养羊生产上使用盐酸克伦特罗是继猪、牛、马、鸡后的又一违法现象，而相比于猪、牛、马、鸡，关于盐酸克伦特罗在羊体内的残留消除规律的研究较少。本研究以绵羊为试验对象，探究盐酸克伦特罗在绵羊可食性组织中的残留规律，进行深入分析与总结，探讨盐酸克伦特罗在绵羊体内的蓄积性，探究监测盐酸克伦特罗非法使用的理想靶标。

1 材料与方法

1.1 试验动物

21只平均体重为（30±5）kg的健康雄性小尾寒羊（辽宁省朝阳市朝牧种畜场提供），饲料为无任何药物的全混合日粮。预饲2 d，自由采食及饮水。

1.2 试验设计

以每天15 μg/kg体重的剂量的盐酸克伦特罗对21只绵羊连续灌胃给药21 d，在最后一次给药后停止给药21 d。

1.3 样品采集

在给药第7、14、21 d（停药0 d）及停药第3、7、14、21 d时，随机屠宰3只绵羊，采集肝脏、肺脏、肾脏、心脏、肌肉样品，迅速置于编号的密封袋中，-20℃保存。

1.4 样品处理及测定

取冷冻样品，在常温下解冻。分别取各组织2 g于50 ml离心管中，加入6 ml pH值5.2的乙酸铵溶液与100 μl 10 μg/l盐酸克伦特罗D9内标溶液（WITEGA公司），用可调高速分散器进行匀浆，加入30 μl β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，在55℃条件下的恒温培养振荡器中酶解2 h，在酶解后的组织中加入1 ml 30%高氯酸溶液，涡旋混合30 s，沉淀蛋白，8 000 r/min离心10 min，取上清液备用；将混合型阳离子交换柱(PCX)置于固相萃取装置上，依次用3 ml甲醇活化，3 ml水平衡，将上述上清液过柱，控制过柱速度在1 ml/min，依次用3 ml水、3 ml甲醇淋洗，用3 ml 5%氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，50℃氮气吹干，用1 ml液相初始溶液（0.1%甲酸水溶液∶乙腈，9∶1）复溶，充分振荡溶解，过0.22 μm滤膜后进行LC-MS/MS检测分析。分析方法参照国家标准GB/T22286-2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》，在此标准基础上进行优化。

1.5 数据处理

分析仪器控制、数据采集通过软件Masslynx 4.1进行。试验数据经Excel软件整理，运用SAS 9.2软件进行方差分析，并使用LSD法进行多重比较，结果以平均值±标准差表示，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 盐酸克伦特罗在组织中的残留分析

不同采样时间点各个组织中盐酸克伦特罗残留浓度见表1。由表1可知，在绵羊主要可食性组织中，肝脏中盐酸克伦特罗残留浓度最高，且显著高于其他组织(P＜0.05)，在给药第7 d时，肝脏中盐酸克伦特罗残留浓度达到了95.94 ng/g，是其他几种组织在同一采样时间点的3～9倍；在给药第14 d时，肝脏中盐酸克伦特罗残留浓度达到了峰值，为121.22 ng/g，随后下降直至试验结束；在停药第21 d时，盐酸克伦特罗在肝脏中的残留浓度为6.46 ng/g，仍在最高残留限量(MRL)的10倍以上。肺脏与肾脏中的盐酸克伦特罗残留浓度在各个采样时间点都比较接近，直到停药第21 d时，肾脏中的盐酸克伦特罗残留浓度下降到最高残留限量以下；肺脏与肾脏中盐酸克伦特罗残留浓度均在给药第7 d时最高，分别为31.45 ng/g和40.77 ng/g，随后下降且消除速率相似，从停药第7 d后，肺脏与肾脏中的盐酸克伦特罗残留浓度均在1 ng/g左右。盐酸克伦特罗在心脏中的残留浓度在整个试验期间都低于肝脏、肺脏、肾脏，但高于肌肉；心脏与肝脏相似，在给药第14 d时，心脏中盐酸克伦特罗残留浓度达到最高值，为10.14 ng/g，且在停药第21 d时其残留浓度为1.51 ng/g，高于肺脏与肾脏，表明心脏中的盐酸克伦特罗消除较慢。肌肉中盐酸克伦特罗残留浓度最低，在给药第7 d时，盐酸克伦特罗残留浓度即在肌肉中达到峰值10.41 ng/g，在停药第21 d时降至0.15 ng/g。

表1 不同采样时间各个组织中盐酸克伦特罗残留浓度(ng/g)

2.2 盐酸克伦特罗在各组织中残留的异同点分析

肝脏中盐酸克伦特罗的残留浓度在整个试验期间都高于其他组织，心脏和肌肉中盐酸克伦特罗的残留浓度一直处于较低水平，肺脏与肾脏中盐酸克伦特罗的残留量非常相近，均低于肝脏，高于心脏与肌肉。肝脏与心脏中盐酸克伦特罗残留浓度在给药第14 d时达到峰值，而且肝脏与心脏的消除趋势比其他组织平缓。肺脏、肾脏与肌肉中盐酸克伦特罗的残留浓度在给药第7 d时达到峰值，肌肉中的含量明显低于肺脏与肾脏。通过对表1中数据进行方差分析，结果发现在95%的置信区间内，在各个采样时间点肝脏中盐酸克伦特罗残留浓度与其在其他四种组织中的残留浓度均存在显著性差异（P＜0.05）；给药第7 d，肺脏与肾脏中盐酸克伦特罗残留浓度差异显著，给药第14 d后，二者之间差异变为不显著（P＜0.05）；从给药第7 d到停药第3 d，心脏与肌肉中盐酸克伦特罗残留浓度差异均不显著（P＞0.05），停药第3 d后，二者之间差异变为显著（P＜0.05）。从给药第7 d到停药第7 d的5个采样时间点，肝脏中盐酸克伦特罗残留浓度存在显著差异（P＜0.05），停药第7 d到第21 d差异消失（P＞0.05）；肺脏、肾脏、肌肉中盐酸克伦特罗在给药第7、14 d，停药第0、3 d采样时间点的残留浓度差异显著（P＜0.05）；停药第3 d后，肺脏、肾脏、心脏、肌肉中盐酸克伦特罗在各采样时间点的残留浓度无显著性差异（P＞0.05）。

3 讨论

本试验结果表明，在绵羊的可食性组织中，肝脏中盐酸克伦特罗残留浓度最高，然后是肺脏与肾脏，心脏与肌肉中残留浓度最低。在停药第0 d，肝脏中盐酸克伦特罗的残留浓度是肺脏和肾脏的4～5倍，是心脏的11倍，这与杨静（2011）在肉羊上的研究结果相似，而Meyer等（1991）的研究显示，停药第0 d时小牛肺脏中盐酸克伦特罗的残留浓度高于肝脏；在停药第21 d，二者都未检测到盐酸克伦特罗，本试验还可以在五种组织中检测到盐酸克伦特罗，这些试验结果的不同，可能是由于给药剂量与试验期时间不同。肺脏与肾脏中盐酸克伦特罗残留浓度只有在给药第7 d存在显著差异（P＜0.05），之后二者的盐酸克伦特罗残留浓度都处于同水平。在整个停药期间，盐酸克伦特罗在肺脏和肾脏中残留浓度与消除模式基本一致（杨静，2011）。盐酸克伦特罗在动物的不同组织中的残留浓度不同与其跟不同组织的β-受体结合能力不同有关，也与组织间的β-受体数量和组织细胞对盐酸克伦特罗的转运能力不同有关。本试验的结果中心脏中的盐酸克伦特罗残留量处于低水平，虽然心脏组织中存在着丰富的β-受体，很多研究表明盐酸克伦特罗在牛、马和猪等动物心脏中残留浓度普遍偏低，说明盐酸克伦特罗与心脏组织中的β-受体亲和度不高，因此可解释本次试验中心脏残留浓度低的原因。除此之外，盐酸克伦特罗与黑色素也有较高的亲和性。Dürsch（1995）等研究表明，盐酸克伦特罗在毛发中也有残留，且深色毛发的残留量要高于浅色毛发，也证明了盐酸克伦特罗的残留蓄积与色素有较强的相关性。国内外还有很多关于盐酸克伦特罗在动物组织和体液中残留的报道，Sauer等（1995）研究结果表明，在动物的眼睛中盐酸克伦特罗含量最高，远高于肝脏。盐酸克伦特罗在脉络膜（含色素上皮细胞）中的含量在整个停药期都至少是肝脏的10倍，在眼睛各组分中的含量依次是脉络膜＞角膜＞巩膜＞视网膜＞房水/玻璃体＞晶状体。Gojmerac（2008）报道了猪饲喂盐酸克伦特罗后停药第14 d眼睛脉络膜（含色素上皮细胞）中的残留浓度是肝脏的143倍，Meyer（1991）在研究牛眼睛中盐酸克伦特罗残留时表明眼睛中的残留浓度是包括肝脏在内的组织中的残留浓度的20～90倍。刘士杰（2006）的研究表明，在试验期间猪尿液中盐酸克伦特罗的含量变化有双峰的趋势，而多数研究表明在给药期反刍动物的尿液中盐酸克伦特罗的残留浓度变化范围大，变化趋势不明显（Meyer，1991；Degand，1992；Sauer，1995）。李阳（2013）对绵羊进行静脉注射给药的试验表明，唾液样品中也存在盐酸克伦特罗，而目前还没有关于猪唾液中盐酸克伦特罗残留的报道。

4 小结

对绵羊连续给药（15 μg/kg体重剂量）21 d后，分别取肝脏、肺脏、肾脏、心脏与肌肉组织样品进行分析，研究盐酸克伦特罗在绵羊组织中的残留规律。结果表明，在可食性组织肝脏中盐酸克伦特罗的残留浓度最高，代谢消除缓慢。肺脏与肾脏中盐酸克伦特罗的残留浓度相近，均低于肝脏。心脏与肌肉中的残留量处于低浓度水平。所以肝脏可作为监测盐酸克伦特罗非法使用的靶标。