胶质细胞源性神经营养因子对帕金森病大鼠多巴胺能神经元的修复作用

许加军，杨洪安，王国栋

(山东大学附属省立医院，济南250021)

胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)有保护多巴胺能神经元和修复其损伤的作用［1～3］，保护作用通常发生在损伤即刻，持续数小时，而修复作用通常在伤后数天至数周才表现出来，并持续较长时间。如在神经元损伤后数小时内或损伤前预防给药，以保护作用为主;如给药覆盖帕金森病整个病程，则以修复作用为主。2013年10～12月，我们向帕金森病模型大鼠脑室或壳核内直接注射GDNF，观察其对大鼠黑质纹状体系统多巴胺能神经元的修复作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物模型的制备 健康雄性SD70大鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。常规饲养，自由进食水。2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，固定于立体定向仪。以前囟为标准参考点，参照大鼠脑立体定位图谱，于右侧前脑内侧束(MFB，A/P:－ 3.6 mm;L:+2.0 mm;V:－ 9.0 mm)及腹侧被盖区(VTA，A/P:－6.0 mm;L:+0.5 mm;V:－8.0 mm)分别立体定向注入12 μg 6-OHDA(3 μg/μL)，注射速度为 1 μL/min，经 2周的跟踪监测，获得39只稳定对侧旋转的帕金森病模型［4］。腹腔麻醉下应用立体定向技术分别在20只大鼠右侧脑室近纹状体侧和19只大鼠双侧壳核中央部放置微型导管(外径0.5 mm)。导管通过一段软管接于埋于侧腹部皮下的缓释泵［5］。无论是单侧脑室置管还是双侧壳核置管，GDNF均能作用于双侧脑区。

1.2 GDNF给药方法 术后1周内所有造模成功大鼠每日通过导管输注赋形剂(10 mmol/L枸橼酸盐、150 mmmol/L NaCl缓冲液)。术后2～3周，15只大鼠(观察A组)脑室内注射人重组GDNF，7.5 μg/d;14只(观察B组)壳核内注射人重组GDNF，7.5 μg/d;5只(对照 A 组)脑室内注射赋形剂，5只(对照B组)壳核内注射赋形剂至实验结束。

1.3 黑质酪氨酸羟化酶阳性(TH+)多巴胺能神经元大小、数量及纹状体TH+神经纤维密度测算 所有动物麻醉后，心内注射肝素化冰生理盐水，然后取其脑组织置于冰脑模上行冠状切片，层厚为1 mm。在包含尾状核、壳核、伏隔核的层面行双侧脑组织打孔取标本。将该层面每侧纹状体按照距离脑室远近分为内侧部、中间部和外侧部三个区域分别进行标本采集。

4℃下，把纹状体冠状切片标本以及整个中脑组织均放在4%的甲醛中固定，然后用滑动切片机切片，取包含黑质、纹状体层面行TH免疫组化染色，光镜下观察。操作按试剂盒说明书进行。采用光学分馏方法对中脑组织多巴胺能神经元进行无偏立体细胞计数，获得TH+神经元数目以及大小(被盖腹侧区域不计入兴趣区域)。计数双侧纹状体TH+神经纤维密度，以侧脑室作为参考点，用1.2 mm×1.2 mm栅格从背到腹计数。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。数据用±s表示。组间比较采用t检验和方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各组大鼠中脑组织黑质TH+多巴胺能神经元大小和数目见表1，纹状体内侧部TH+神经纤维密度见表2。由表1、表2可见，对照A、B组大鼠右侧中脑组织黑质TH+多巴胺能神经元大小和数目及纹状体内侧部TH+神经纤维密度均较左侧降低，P均＜0.05。观察A组与对照A组相比、观察B组与对照B组相比，双侧中脑组织黑质TH+多巴胺能神经元大小和数目及纹状体内侧部TH+神经纤维密度均明显升高，P均＜0.05。

表1 各组大鼠中脑组织黑质TH+多巴胺能神经元大小和数目比较(±s)

表1 各组大鼠中脑组织黑质TH+多巴胺能神经元大小和数目比较(±s)

注:与对照 A组相比，*P ＜0.05;与对照 B 组相比，#P ＜0.05

组别 n 神经元数目(个/HP)左侧 右侧神经元大小(μm2)左侧 右侧观察A组 15 242 325±11 053*51 300±13 862* 392±47* 309±33*观察B组 14 270 675±10 126 67 500±11 622 472±25 302±22对照A组 5 194 400±11 086 32 400±1788 303±25 231±9对照B组 5 204 930±12 367#35 370±1 986# 309±40# 232±14#

表2 各组大鼠纹状体内侧部TH+神经纤维密度比较(±s)

表2 各组大鼠纹状体内侧部TH+神经纤维密度比较(±s)

注:与对照 A 组相比，*P ＜0.05;与对照 B 组相比，#P ＜0.05

组别 n TH+神经纤维密度(条/HP)左侧 右侧观察 A 组 15 93.4 ±1.1* 6.4 ±7.3*观察 B 组 14 91.7 ±0.2# 14.6 ±3.6#对照 A 组 5 91.5 ±1.8 2.8 ±0.6对照B组5 79.0 ±2.0 6.8 ±0.9

3 讨论

本研究结果显示向帕金森大鼠脑室或纹状体内输注GNDF对黑质纹状体系统多巴胺能神经元具有显著性修复作用，可增加脑组织黑质TH+多巴胺能神经元大小和数目及纹状体内侧部TH+神经纤维密度，改善黑质纹状体系统功能。金美芳等［1］采用慢病毒作载体，使GDNF基因在PD模型黑质纹状体部位持续表达，结果与本研究大体相同，但其转染GDNF基因是实验损毁1周后进行，主要强调GDNF对黑质纹状体的保护功能。另外在其研究中，脑内GDNF给药剂量无法控制，不能长期监测。本研究中GDNF给药始于损毁后2周，避开了GDNF保护作用有效期［6］，明确观察GDNF对多巴胺能神经元显著修复作用。

本研究结果显示壳核或者脑室内注射均可以收到良好的神经元修复效果，这与既往研究［7］结论一致。GDNF对残存多巴胺神经纤维具有显著修复作用，这与文献［8］结论一致。对照组近脑室侧纹状体TH+神经纤维密度最高，说明残存纤维主要集中在近脑室纹状体，而在实验组，纤维再生和修复最明显也发生在近脑室纹状体，说明GDNF神经修复作用主要作用对象为损毁后残存神经纤维，这正是GDNF能够上调黑质纹状体系统多巴胺能神经元活性主要机制。

本研究结果显示，脑室内或壳核内输注GDNF不但能修复损毁侧黑质神经元，还能显著增加健侧黑质神经元数目，这与文献［9］结果相同。故认为脑室内或壳核内注射GDNF可以通过扩散逆向运输在黑质等邻近脑区广泛分布［10］。目前有证据表明帕金森动物模型中黑质神经元调亡前会出现多巴胺表型丢失，从而造成这些神经元活性丧失［11］(即这些细胞并不表达TH)，这可以作为GDNF发挥作用的靶细胞。目前有证据表明在成年动物新皮层、纹状体和黑质等部分脑区均存在神经再生［12］。所以GDNF也可能通过促进神经再生途径对黑质纹状体细胞进行修复。

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