MicroRNAs在心力衰竭中的研究进展

庞秀峰 李纪明 李莹

综 述

MicroRNAs在心力衰竭中的研究进展

庞秀峰 李纪明 李莹

作者单位：200120 上海市，同济大学附属东方医院心内科

MiRNAs； 心脏疾病； 心力衰竭； 诊断标志物； 治疗靶点

MiRNAs存在多种形式，最初是pri-miRNA。miRNAs相对应的基因来源于染色体非编码区，在细胞核内由RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ，RNApolⅡ）转录生成长度为100～1000 nt的初级miRNA（primary miRNA，pri-miRNA）。pri-miRNA在双链RNA特异的核酸酶Drosha及DGCR8（Di－Geogecritical region-8）结合蛋白作用下，被剪切成长70～90 nt的具有茎环结构的前体miRNA（precursor miRNA，pre-miRNA）。pre-miRNA在GTP依赖的核质/细胞质转运蛋白Exportin5的作用下，从细胞核运送到细胞质，在细胞质中，ATP依赖的核酸内切酶Dicer将pre-miRNA剪切成19～22 nt的双链miRNA[1]。其中 DICER-LIKE1a蛋白促进miRNA成熟，DICER-LIKE1b蛋白则转而控制miRNA的靶位调控作用。随后双链miRNA解旋，其中一条链被降解，另一条链被PPD（PAZ and Piwi domain）蛋白家族成员识别，形成RNA-蛋白复合体，并最终进入RNA诱导的基因沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）中，形成非对称RISC复合物[2-4]。miRNAs的表达方式各不相同。部分线虫和果蝇的miRNA在各个发育阶段的全部细胞中都有表达，而其他的miRNA则依据某种更为严谨的位相和时相的表达模式（a more restricted spatial and temporal expression pattern）——在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异。目前人们发现的与心力衰竭有关的miRNA包括 miRNA-208a、miRNA-21、miRNA-1 和 miRNA-133，miRNA-21、miRNA-499、miRNA-186、miRNA-423-5p、miRNA-126 和 miRNA-195。

1 MiRNAs

上述 miRNAs研究较多的有 miRNA-208a、miRNA-21、miRNA-133 和 miRNA-1、miRNA-499、miRNA-423-5p、miRNA-126，现分别阐述如下。

1.1 miRNA-208a MiRNA-208a是目前发现的唯一心脏特异性表达的miRNA，由a-肌球蛋白重链（a-MHC）基因的27位内含子编码，仅在应激作用下调剂β肌球蛋白重链（β-MHC），是心衰发展过程中联接应激信号与下游基因和蛋白表达的组织特异性节点[5]。Vanderheyden等[6]研究发现，对不同物种来说，不管是下调 Myh6（α-肌球蛋白重链）或者是上调Myh7（β-肌球蛋白重链）得到的结果是相同的，即对心肌有保护作用，抵抗心肌肥大的发生。Callis等[7]和van Rooij等[8]都发现，尽管在多种心脏压力存在的情况下，遗传缺失miR-208基因的小鼠不能在基线产生明显的表型，然而miRNA-208基因无效的小鼠基本无明确的心肌肥厚或心肌纤维化的表现，同时也无法下调Myh7的表达。Rusty等[9]研究发现，给予实验小鼠全身运用一种反义寡核苷酸，会导致该小鼠心脏的miRNA-208a基因有效而持久地沉默；并通过皮下注射miR-NA-208a抑制剂抑制其作用来治疗高血压诱导的心力衰竭达尔高血压大鼠，其结果是可以剂量依赖性阻止病理性肌球蛋白的转换及心肌重塑，从而提高心功能、总体健康及生存率。转录分析表明，miRNA-208a抑制剂能显著影响心脏基因的表达。血浆分析表明，循环血中miRNAs的水平会因为通过miRNA-208a抑制剂的治疗而发生重大变化。这些研究表明，miRNA-208a能导致心肌肥厚及心力衰竭的发生，反义寡核苷酸治疗有调整心肌miRNAs表达情况的潜能，有效证实了miRNA-208a能作为调整心衰发展过程中心脏功能及重塑的有效治疗靶点。甲状腺功能亢进能促进心肌肥厚从而导致心力衰竭，血管紧张素Ⅰ受体（AT1R）已被证明参与这一过程。最近的研究以发现，有miRNAs在逆转心功能方面起重大作用。在此基础上，Diniz等[10]研究发现，在甲状腺功能亢进组miR-208b/β-MHC的表达是下调的，与此相反，miRNA-208a/a-MHC是上调的，同时提示AT1R参与提高了甲状腺功能亢进导致心功能不全患者心肌的miNAR-208a/a-MHC的水平，但是未参与miNAR-208b/β-MHC的下降。

1.2 miRNA-21 关于miRNA-21对心肌细胞的影响仍然存在着一定的争议，Patrick等和Thum等分别得出了两个完全相反的结论。Thum等[11,12]之前研究表明，啮齿动物运用胆固醇改良的miRNA-21抑制剂后明显抑制了心肌肥大的发生及伴随的心肌纤维化反应。然而Patrick等[13]表示，尽管最近许多证据表明miRNA-21在啮齿动物心衰调节中发挥重要的作用，然而他们的研究表明，miRNA-21基因序列切除小鼠的心脏表型无明显变化。其机制可能是通过与靶基因FASL及转录因子受体相互作用，从而引起心肌抗凋亡途径，但还需进一步证实。导致这两位研究者研究结果差异的原因可能是两者选用的抑制剂或者运用的途径不同。另外，Roy等[14]发现，miRNA-21在成纤维细胞中通过作用于磷酸酶和张力蛋白类似物（PTEN）来诱导基质金属蛋白的表达。Cardin等[15]通过对研究心肌梗死后心力衰竭的大鼠发现，心肌梗死后心力衰竭的大鼠能够导致房颤心房重塑，敲除大鼠心房miRNA-21基因后能抑制心房纤维化及房颤的进展，从而得出结论，miRNA-21是房颤的重要分子信号，同时也表明它是从分子方面干预房颤的潜在靶点。

1.3 miRNA-1和miRNA-133 研究发现，miRNA-133的上调能抑制心肌肥厚和心力衰竭的发生和发展。Belevych等[16]通过实时定量RT-PCR实验发现，心力衰竭心肌细胞中成熟miRNA-1及miRNA-133的表达水平比对照组显著升高，并通过 Western blot分析发现，B56a、B56调节器 和PP2A的酶催化亚单位这些miRNA-1和miR-133的假定靶点在心衰心肌中比对照组显著减少，可能是因为miRNA-1和miRNA-133的假定靶点减少，从而导致心肌肥厚及心力衰竭发展。Duisters等[17]从4个方面明确了miRNA-133和miRNA-30c是通过调节结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）来控制心衰心肌细胞外基质的结构改变。首先他发现在2个啮齿动物的心脏病模型中和1个人的病理性左室肥大的心肌中以上两种miRNAs的表达与CTGF的量呈负相关。第二，在人工培养的心肌细胞及成纤维细胞中，敲除这两个基因将会使CTGF的数量增加。第三，在过表达miRNA-133或者miRNA-30c时，在减少CTGF水平的同时产生的胶原也减少。第四，他们发现CTGF是这些miRNAs的直接靶点，因为它们是直接与CTGF的3’非编码区相互作用的。这四点结合起来得出结论，miRNA-133和 miRNA-30在限制CTGF产生方面起着重要作用。Ellison等[18]曾发现，IGF-1/PI3K-Akt信号通路在心肌生理重构方面起到重要的作用。为了启动IGF-1信号细胞内反应，激活的内在受体酪氨酸激酶磷酸化细胞内的一些底物如胰岛素受体底物1和SH2包含蛋白，这些底物能招募和激活包括PI3K/Akt通路在内的下游信号转导通路。而IGF-1信号通路调节异常也会参与病理性心肌肥大[19]。最近的一些研究显示，miRNAs在心脏的病理学及生理学条件下介导IGF-1通路的效应中担当重要的角色。在运动训练的大鼠和生理性心肌肥大的Akt转基因小鼠的心肌中miRNA-1和 miRNA-133的表达是下调的[20,21]。从上述的研究结果得出结论，miRNA-1和 miRNA-133通过IGF-1/PI3K-Akt信号通路影响心肌的生理性重构，当Akt表达增加会产生负反馈调节使miRNA-1和 miRNA-133表达下降。Danowski等[22]的研究却发现如下结果：83例因冠状动脉疾病行搭桥手术的患者中，通过比较心脏指数、血管压力及miRNA-133的表达量与心力衰竭之间的关系发现，心力衰竭越严重（NYHA心功能分级），miRNA-133的表达量越下降，且NT-proBNP＞1800 pg/ml的患者miRNA-133的表达量比NT-proBNP＜300 pg/ml的患者低25%。并且通过比较发现，心力衰竭严重程度与miRNA-1的表达无关。糖尿病导致的心肌病是一系列复杂的事件导致心力衰竭及心肌纤维化。Chen等[23]研究发现，链尿霉素诱导的糖尿病动物心脏中miRNA-133的表达急剧下降，伴随着其下降升高的是在转录中激活的EP300 mRNA和纤维化的标记因子［转化生长因子-β1、结缔组织生长因子、纤维连接蛋白（FN1）和COL4A1］。有趣的是，在糖尿病小鼠的心脏中心肌特有的miRNA-133a基因超标可以显著减轻去心肌纤维化同时抑制ERK1/2和SMAD-2的磷酸化，从而得出结论：miRNA-133a是治疗糖尿病导致的心肌纤维化及其导致的心功能不全的潜在靶点。

1.4 miRNA-499 研究发现，miRNA-499是心肌肌球蛋白myh7b的内含子基因，它们和miRNA-208a、miRNA-208b之间组成了一个复杂的网络关系，这些miRNAs与它们的宿主MHC基因通过一样的转录事件和信号通过来共同表达和调节。miRNA-499在通过规范化识别肌纤维来启动慢肌纤维基因程序和压制快肌纤维基因程序中起着很大作用[7]。在心脏中提高miR-499的水平能通过调节即早反应基因部分改变心肌的应激反应，并通过剂量依赖的方式导致心肌肥大和心肌病，尤其是在压力超负荷情况下[24]。miRNA-499在人的和鼠科动物的肥大心肌和心肌病心肌中的表达是增加的，并足以导致鼠科动物心力衰竭，而且加速对超负荷压力的适应不良。miRNA-499这种有害影响反映了直接和间接mRNA调控的累积结果，即对心肌酶和磷酸酶通路的调节和对心肌蛋白翻译后修饰高阶效应。另外，Matkovich等通过全基因组RNA诱导的基因沉默复合物和RNA序列识别了67种直接的和间接的心肌mRNAs靶点，包括Akt和MAPKs。心肌蛋白质组学确定改变蛋白磷酸化与miR-499的心肌病型有关，包括HSP90和PP1α[25]。

1.5 miRNA-423-5p Tijsen等用12名健康人和12个心衰患者的血清做了一个miRNA阵列，从这个阵列中选择出16个miRNAs，在39名健康人和50例有呼吸困难（其中30例被诊断为心力衰竭引起的呼吸困难，20例被诊断为非心力衰竭引起的呼吸困难）患者中做了二次临床研究。研究发现，在心衰患者的血清中miRNA-423-5p尤其丰富。通过ROC曲线分析发现，miRNA423-5p是心衰的诊断预言者（曲线下面积0.91，P＜0.001），而且miRNA423-5p与NT-proBNP和NYHA分级密切相关。但是miRNA423-5p的升高是心肌缺血产物随后释放入血导致的，还是其他作用机制使其升高的仍然是个未解之谜。另外有5种miRNAs（miRNA129-5p、miRNA18b、HS-202.1、miRNA622、miRNA1254）在心衰患者中升高，但在非心衰引起的呼吸困难患者中也有轻微升高。从上述研究得出结论，以上6种miRNAs在心衰患者中的表达都是升高的，且其中miRNA423-5p对于心衰临床诊断关系最密切。对于其他5种来说，虽然在非心力衰竭引起的呼吸困难组也有轻微升高，像NT-proBNP在肺脏右心超负荷患者中也会轻微升高一样，也可能作为循环血中心衰诊断的生物标记物，但仍需要进一步研究证实[26]。Goren等[27]也证明，心衰患者血清的miRNA-423-5p表达较健康人高，敏感性及特异性达90%，说明血清中miRNA423-5p指标可作为心衰患者诊断标记物并可评估预后。另外，Dickinson等[28]通过实时定量PCR分析也发现，miRNA-423-5p在高血压导致的心力衰竭患者血液循环中的表达水平显著升高。Fan等[29]研究中，45例扩张性心肌病导致心力衰竭的患者与39例年龄与性别无差异的健康人比较发现，扩张性心肌病导致心力衰竭患者血清中miRNA-423-5p的表达水平明显升高，而且血清中miRNA-423-5p的浓度与NT-proBNP的表达水平呈正相关，循环血中miRNA-423-5p水平可作为扩张性心肌病导致的心力衰竭患者的诊断标记物。

1.6 miRNA-126 有趣的是，最近的一项研究表明，缺血性心脏衰竭患者循环内皮细胞中含有丰富的miRNA-126[30]，miRNA-126对缺血诱导的血管生成和控制内皮细胞功能起到重要的作用[31,32]。miRNA-126的血清水平和BNP呈负相关的，而且是通过NYHA分级与升高的miRNA-126之间的关系表明其临床疗效[33]。尽管有几个研究都表明，miRNA-126能使心衰患者的内皮功能恶化和影响血管再生，但是通过减少miR-126水平的生物学意义仍有待决定。另一研究表明，在充血性心力衰竭患者中缺少循环CD34+细胞和血管生成中的angiomiRNA-126和-130a，减少miRNA-126的表达被认为是一个限制它们提高心肌心血管形成和可作为miRNA-126模拟转染靶点功能的能力[34]。但是miRNA-126在心衰中的表达没有特异性，因为研究发现miRNA-126的表达会受到年龄的影响，而且研究发现，在包括肝脏疾病、心肌梗死等许多其他心血管疾病中的表达和正常对照都有差异。Liu等[35]对106位慢性心力衰竭患者和30位健康人随访24个月或心血管原因死亡为终点，发现miRNA-126和miRNA-508-5p与缺血性心脏病和非缺血性心脏病的慢性心力衰竭患者都有密切关系，在慢性心力衰竭患者的内皮祖细胞（EPCs）中miRNA-126和miRNA-508-5p的表达水平是慢性心力衰竭患者预后的独立相关因素；对其信号通路进行分析发现，miRNA-126和miRNA-508-5p最可能通过调节血管生成这条通路来影响慢性心力衰竭患者的预后。因此，miRNA-126和miRNA-508-5p在慢性心力衰竭的诊断中发挥重要作用，同时可能成为防止心力衰竭的发生及治疗慢性心力衰竭的新靶点。

2 结论和展望

MiRNA自发现以来一直是研究的热点问题，也取得了一定的成果，特别是在其与心脏疾病的关系方面。如miRNA心衰模型心肌中差异表达的有哪些？某些miRNA在这些疾病的发挥作用的机制？这些问题为miRNA在心力衰竭中的诊断和治疗都提供了新思路，可能会成为科学家们研究的又一热点问题，为以后心脏疾病的诊断和治疗开辟新的道路。最初miRNA的表达研究都是在心肌中进行的，而研究最后的服务对象是患者，而患者的心肌组织标本的获取很难。研究发现miRNA可以游离于外周血中，并且能稳定存在，并且能抵抗4℃～80℃的冻融，具备疾病分子生物标志物的某些优点，因此研究者开始探索外周血中miRNA的表达情况。研究者对比了心衰和非心衰外周中miRNA的表达，发现 miRNA-435-5p、miRNA-129-5P、miRNA-675、miRNA-18b、miRNA-1254、miRNA-622、HS-202.1，其中miRNA-435-5P和miRNA-18与血清BNP呈正相关，提示其可能是心衰的潜力标志物。这些研究使我们能把关于对miRNAs的研究进一步运用于临床提供的研究基础。但是还存在一些问题，如这些miRNAs的靶点及作用机制仍有待进一步研究。

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Micro-RNAs’research progress in heart failure

MiRNA； Heart disease； Heart failure； Diagnostic marker； Therapeutic targets

浦东新区卫生系统优秀青年医学人才培养计划项目资助（项目编号：PWRq2011-01）

李莹，E-mail：yingcnli@163.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2014.04.017

R541.6

A

1672-5301（2014）04-0347－05

2013-12-30）