肿瘤抗血管生成治疗耐药分子机制研究进展

罗翠莲综述；文庆莲审校

(1．泸州医学院，四川泸州646000;2．泸州医学院附属医院肿瘤科，四川泸州646000)

自1971年Folkman首次提出“新生血管对肿瘤生长至关重要”的概念［1］以来，抗血管生成是除手术、放化疗以外的有效治疗肿瘤方法之一。血管生成抑制剂影响新生血管形成，从而阻断肿瘤的生长和转移，可改善患者的生存状况，但并没有延长PFS、改善OS，这可能与出现了耐药有关。目前，肿瘤抗血管生成治疗耐药机制尚未阐明，本文主要综述肿瘤抗血管生成治疗耐药分子机制的研究进展。

1 肿瘤耐药现象

血管生成抑制剂主要针对的是血管内皮细胞，而内皮细胞遗传上相对稳定，因此，我们过去认为这类药物很难产生耐药性。随着血管生成抑制剂的广泛运用和深入研究，逐渐认识到这些药物虽然取得了一定疗效，但并没有带来大家期望的临床结果［2］。目前，许多研究表明肿瘤能够适应血管生成抑制剂的存在，逃避抗血管生成治疗，即肿瘤对血管生成抑制剂产生了耐药现象。

越来越多的研究表明，许多肿瘤患者在接受血管抑制剂治疗时或治疗数月后，出现耐药现象。Kindler等［3］入组602例晚期胰腺癌患者进行了临床研究，分为吉西他滨(gemcitabine)+安慰剂组与吉西他滨+贝伐单抗(bevacizumab)组，但结果显示两组的中位PFS、有效率(response rate，RR)差异无统计学意义，表明联合贝伐单抗并没有改善OS。Bao等［4］入组126例晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung canser，NSCLC)患者，分为紫杉醇(paclitaxe)+顺铂(cisplatin)+恩度(endostar)组和紫杉醇+顺铂+安慰剂组，发现恩度组并没有提高PFS和OS。黄银梅［5］对64例初治NSCLC患者进行研究，其中吉西他滨+铂类+恩度组22例，吉西他滨+铂类组42例，两组均无完全缓解(complete remission，CR)患者，两组中位生存时间(median survival time，MST)、疾病控制率(disease control rate，DCR)、部分缓解率(partial remission rate，PRR)及总的客观有效率(objective response rate，ORR)差异在统计学上并没有意义。由此得知，表面上有效的血管生成抑制剂治疗后，肿瘤继续生长和演进似乎不可避免，原因可能在于肿瘤对血管生成抑制剂产生了耐药。

2 肿瘤抗血管生成耐药的分子机制

2．1 替代性促血管生成因子或通道的增强表达

2．1．1 替代性促血管生成因子的增强表达

肿瘤新生血管生成的主要促进因子是血管内皮生长因子(vascular endothelial cell growth factor，VEGF)，其与受体(vascular endothelial cell growth factor receptor，VEGFR)结合后传导信号，引起肿瘤内皮细胞增殖、迁移，诱导新生血管生成，目前“VEGF-VEGFR”轴是抗血管生成治疗主要作用靶点。但肿瘤发生发展同时存在多种血管生成因子、多条血管生成信号通路的失调，可以推测，当VEGF信号通路被阻断后可能会出现其他生成因子、信号通路活性的增强。许多研究表明，在肿瘤的发展中可以产生成纤维细胞生长因子(fibroblast growth fac-tor，FGF)、胎盘生长因子(placental growth factor，PLGF)、血小板衍生生长因子(plated-derived growth，PDGF)、基质细胞衍生因子(stromal cell derived factor1 alpha，SDF-1α)、血管生成素 (angiopoietin，Ang)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等其他促血管生成因子。抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)在治疗胰腺肿瘤短期有效后，因FGF1、FGF2、Ang-1等表达上调导致肿瘤复发，而在开始治疗同时应用阻断FGF1/FGF2信号通路的FGF相关蛋白，则可以使肿瘤的复发率降低［6］。Chung等研究表明，在一些模型中短期VEGF-VEGFR的抑制反而加速了肿瘤的侵袭和转移，肿瘤通过肿瘤细胞分泌SDF-1α影响循环中内皮前体细胞诱导新生血管形成来逃避抗血管生成治疗［7，8］。

2．1．2 Dll4/Notch 信号通路

最近研究发现了与肿瘤血管生成相关的另一关键通路——Dll4/Notch信号通路［9］。许多细胞表面可以表达Notch受体，受体与其跨膜配体结合后传导信号，发挥调节细胞增殖、分化和凋亡的作用。Notch受体有多种跨膜配体，与血管生成相关的Delta样配体4(delta-like ligand 4，Dll4)只表达于内皮细胞表面。研究表明，肿瘤细胞中Dll4的表达水平相当高，提示抗Dll4/Notch信号通路靶向药物可能存在很大抗癌作用。Dll4基因及蛋白在A549细胞中表达，特异性阻断Dll4/Notch信号通路能有效促进A549细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成来达到阻遏肿瘤的生长［10］。Dll4信号通路抑制剂怎样降低肿瘤血供，影响肿瘤生长目前尚在研究中。有研究发现，肿瘤应用抗Dll4信号通路的药物后，增加了肿瘤的新生血管数量，但这些血管畸形且不能很好地提供血液，肿瘤的生长因血供明显降低而被遏制了［11］。另有研究发现，Notch信号通路抑制剂二苯丙氮卓(DBZ)可使新生大血管断裂，提高贝伐单抗的疗效［12］。据报道，对抗 VEGF治疗耐药的肿瘤可以对Dll4/Notch通路的抑制剂产生反应。由此可知，肿瘤生长可以不依赖于 VEGF通路，Dll4/Notch信号途径可使肿瘤获得血供继续生长，从而可能导致了肿瘤对血管生成抑制剂的耐药性。

2．2 肿瘤缺氧环境

2．2．1 缺氧易动员骨髓来源细胞

血管生成抑制剂抑制血管生成后，肿瘤血供相对不足而形成了缺氧微环境，它可以动员参与肿瘤新生血管形成的骨髓来源细胞。与此相关的骨髓来源细胞包括血管干细胞和血管形成调控细胞，前者如:内皮干细胞、管周干细胞等参与血管形态构成，后者如:肿瘤相关巨噬细胞、CD11b+髓细胞等通过分泌各种细胞因子、生长因子、蛋白酶来调控血管生成。研究者应用小鼠模型发现，对抗血管生成治疗抵抗的肿瘤中存在更多的CD11b+Gr1+髓系细胞，且分离这些细胞后发现其可以介导肿瘤抵抗性的形成［13］。缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是肿瘤缺氧的主要调控者，对肿瘤的发生发展、新生血管生成、凋亡等起着重要作用。Du等［14］在研究神经胶质瘤过程中发现，在缺乏HIF的对照组中，骨髓源性细胞较少，肿瘤血管生成被抑制;而实验组中肿瘤的新生血管明显增多，这与HIF募集髓源性CD45+、CDl33+细胞参与血管生成相关。另外有报道，CD11b+Gr1+细胞可以激活肿瘤基质细胞分泌白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、SDF-1α、粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF)等因子促进血管增生，使肿瘤对血管生成抑制剂产生耐药［15］。

2．2．2 缺氧致血管重构(vascular remodeling，VR)

血管重构是慢性缺氧的重要标志，肿瘤由于自身的生长特性易出现缺血缺氧，且抗血管生成治疗会进一步加重其缺血缺氧，因此很可能会出现VR。重构的中心血管管腔直径增大，血管壁细胞(vascular mural cell，VMC)增殖，ephrinB2等因子表达增加，重构血管的稳定性增加。据报道，抗VEGF治疗停止后会出现快速的肿瘤血运重建［16］。Huang等［17］研究表明，长期使用血管生成抑制剂后，肿瘤出现了VR，这些血管稳定性提高，更好地增加了肿瘤血供，促进其生长、进展。长期抗血管治疗的肿瘤发生耐药，其获得性耐药机制可能是肿瘤通过重塑的稳定性增加的血管来适应治疗。

2．3 血管生成方式多样性

2．3．1 血管生成拟态(vasculogenic mimicry，VM)

传统的出芽式血管生成(sprouting angiogenesis)是指在促血管生成因子刺激下，内皮细胞迁移、分化、增殖排列成条索状形成新生血管。VM血供模式由肿瘤细胞分化成血管内皮样细胞构成血管通道，重塑肿瘤微循环，可供给肿瘤血液、营养，其特点是生成过程没有内皮细胞的参与。恶性黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌等多种肿瘤内发现了VM供血模式。研究显示，有VM瘤体直径可达1cm而中央不易缺血坏死，这类肿瘤更容易生长、发展、转移，缺乏VM的瘤体中央因缺血而容易坏死［18］。Liu等［19］入组的80例恶性星形细胞瘤病例中发现8例VM，同时发现，内皮抑素(endostatin)对存在VM的U251星形细胞瘤治疗作用不显著。抗血管生成治疗的目标通常是新生血管内皮细胞，存在VM的瘤体治疗失败的原因可能是由于这类肿瘤不依靠血管内皮细胞。

2．3．2 套入式血管生成(intussusceptive angiogenesis)

套入式血管生成现象是Caduff在1986年发现的，其生成过程大致如下:相邻的肿瘤血管壁逐渐向血管腔内凹陷;相互靠近接触、相吻、融合;融合的地方管壁变薄，双分子间出现小孔;小孔逐渐增大最后形成穿过毛细血管管腔的管道，即套入式血管。与传统的出芽式血管相比，其有三大特点:(1)套入式血管生成的速度很快，一般只需数小时，有时在数分钟内就可形成;(2)血管生成时只有很少的内皮细胞增殖，甚至无需增殖;(3)血管通透性低。肿瘤的生长及转移与套入式血管的这些特点密切相关［20］。Burri等研究发现肿瘤直径小于0．8cm 时主要是出芽式血管生成方式，当肿瘤更大时则依靠套入式血管获得血供［21］。可以推测，肿瘤较小时，肿瘤依赖于出芽式血管生长，当肿瘤较大时需要高密度血管，出芽式血管不能满足肿瘤生长需要，这时可能激活套入式血管生成。套入式血管生成过程中很少甚至没有内皮细胞分化、增殖，更多的是内皮细胞迁移形成管道，抗VEGF抑制内皮细胞增殖的治疗并不能对套入式血管生成发挥作用，从而能很好地逃避抗血管生成治疗;那么，抑制内皮细胞迁移的治疗能更好地抗套入式血管形成［22］。

2．3．3 血管共选择(vessel co-option)

肿瘤血管生成抑制剂按作用机制大致可分为间接和直接血管生成抑制剂两类。前者主要通过抑制一种甚至几种促血管生成因子来阻断血管生成的下游信号通路，间接影响内皮细胞增殖及新生血管生成，从而抑制肿瘤生长、进展和转移。直接肿瘤血管生成抑制剂直接对内皮细胞产生作用，影响肿瘤细胞的调节通路，从而遏制新生血管的生成。其作用如下:①抑制肿瘤内皮细胞的分化、增殖、迁移或诱导其凋亡;②防止肿瘤的迁移或内皮细胞管型的形成;③抑制活化的内皮细胞中的基质金属蛋白酶(MMPs)活性。血管生成抑制剂通过抑制新生血管生成、切断血供通道而达到“饿死”肿瘤的作用。随着研究的深入发现，肿瘤生长可利用周围现存的血管获得血供，而自身并没有新生血管生成［23］。Wesseling等［24］研究也表明，有些血供丰富的组织如脑、肺等处的肿瘤可不启动新生血管生成，其肿瘤细胞沿着原有的血管生长，即依赖周围已存在的血管生长，我们称之为血管共选择。另外，在恶性胶质瘤、黑色素瘤移植模型中均发现应用抗VEGF药物治疗后，肿瘤可以通过血管共选择来促进肿瘤的生长、进展［25，26］。血管生成抑制剂的作用原理是针对新生血管，而血管共选择并不存在新生血管的形成，因此血管生成抑制剂并不能对利用血管共选择获得血液的肿瘤很好地发挥作用，这部分肿瘤易产生耐药。

2．4 肿瘤细胞自身改变

2．4．1 肿瘤细胞的异质性(heterogeneity)

肿瘤在演进过程中，其子代细胞可发生诸多改变如:基因、大分子变化来适应新的环境及抗癌治疗，不断进化的子代细胞生长速度更快、侵袭力更强、对抗癌药更易产生耐药等，这些细胞拥有异质性能更好地生存、发展。异质性肿瘤细胞比一般细胞更有生存优势，逐渐被肿瘤选择并保留下来，长期抗血管治疗后，此类细胞对血管的依赖性减少，在缺血、缺氧环境中亦能继续生长，抵抗抗血管治疗［27］。目前也有研究表明在低氧条件下培养的肿瘤细胞更富有侵袭性、转移性。

p53基因是人类重要的抑癌基因，与抑制肿瘤血管生成也密切相关，p53基因发生突变、缺失将影响血管生成及肿瘤的发生发展。研究显示，p53突变型的肿瘤血管密度、血管数目高于p53野生型的肿瘤［28，29］。另有研究表明，p53基因突变或缺失的肿瘤细胞可以更好的生存、抗凋亡能力增强。可以推测，p53野生型的肿瘤细胞对氧和血供的要求高于p53突变型，p53突变型细胞及其亚群细胞更有生存优势，特别是在抗血管生成治疗过程中。Klement等比较了p53+/+和p53-/-HCT116人结直肠癌细胞对抗肿瘤血管生成药物的反应，p53基因的存在可以使治疗效果更佳，p53基因的缺失则不利于抗肿瘤治疗［30］。

2．4．2 肿瘤细胞自噬

自噬是指自噬体(autophagosome)与溶酶体(lysosome)结合形成自噬溶酶体(autolysosome)，自噬溶酶体促使细胞中多余或受损的大分子、细胞器降解，降解产物被循环利用，从而让细胞的内环境处于一个相对稳定的状态［31］，研究提示，自噬现象对肿瘤形成具有促进和抑制两个方面的作用。一方面，在肿瘤早期自噬抑制肿瘤细胞的生长，肿瘤细胞通过自噬清除受损的细胞器，减轻炎症反应，维持细胞的内稳态，保护正常细胞的生长。另一方面，在肿瘤进展中，在缺血缺氧或营养不足的状态下，肿瘤细胞则通过自噬降解、循环再利用细胞内物质，促进自身存活，即自噬有助于肿瘤细胞在不利环境下存活从而促进肿瘤生长。抗血管生成治疗致新生血管生成减少，肿瘤出现缺血缺氧促进肿瘤细胞自噬，肿瘤细胞存活能力增强从而对抗血管生成治疗产生耐药。Hu等［32］研究发现在抗血管治疗后，加剧了肿瘤微环境缺氧，HIF-1α和 AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)的表达上调，细胞自噬增加，从而导致肿瘤对抗血管治疗的抵抗。伊马替尼(imatinib，IM)等TKI治疗白血病临床疗效有限，其耐药现象越来越严重，耐药原因主要是细胞自噬的形成［33］，对于耐IM慢性髓系白血病在自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyla-denine，3-MA)及氯喹(chloroquine)治疗以后，增强了伏立诺他(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)对肿瘤的细胞毒作用［34］。因此，有学者指出肿瘤早期可使用自噬增强剂来加强细胞自噬能力;在肿瘤晚期则应用自噬抑制剂阻止细胞自噬，以达到克服抗血管生成治疗耐药及抗癌作用。

2．4．3 肿瘤细胞围管浸润

Du等［14］发现多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)小鼠的血管生成基因VEGF、HIF-lα被敲除或药物抑制VEGF后，肿瘤向周围组织侵袭方式是以细胞团的形式沿着正常血管生长，而对照组的肿瘤侵袭形式是单个细胞沿着血管基底膜及脑室生长。Norden等入组贝伐单抗治疗后复发的GBM患者，MRI观察到了类似以上的围管浸润现象［35］。GBM 细胞表达 VEGFR-1/2，VEGF信号可对肿瘤细胞围管浸润有一定制约作用，当VEGF信号通路被血管生成抑制剂阻断后，相应的是增强了肿瘤细胞围管浸润信号的表达，从而对血管生成抑制剂产生抵抗［36］。

2．5 其它耐药机制

肿瘤细胞的多重耐药(multdrug resistance，MDR)机制与ATP结合蛋白(ATP-binging cassette，ABC)型膜载体蛋白家族参与相关，ABC的作用机制是将细胞内多种抗肿瘤药物(如化疗药物等)泵到细胞外，细胞内的药物浓度降低而不能充分发挥抗癌作用。Suneet Shukla等［37］研究发现TKI也可被ABC转运，导致药物动力学的改变及产生耐药。管周细胞通过分泌旁分泌因子刺激血管内皮细胞分化及生存信号通路，调节血管的稳定和成熟，内皮细胞可通过增加周细胞的保护而免受抗VEGF治疗，是耐药产生的又一原因。正常内皮细胞因遗传上相对稳定不易产生耐药性，肿瘤的内皮细胞易发生遗传改变而更好地逃避抗血管治疗。Xiong等［38］研究发现，在促血管形成、粘附肿瘤细胞、抗凋亡能力方面，CD105+肝癌内皮细胞强于CD105+正常内皮细胞、人脐静脉内皮细胞，也容易对索拉非尼(sorafenib)也产生耐药。另外，耐药性的产生还与原发性耐药、VEGF单核苷酸多态性、临床用药剂量等密切相关。肿瘤耐药机制涉及到多种因子、多种调控，且各种因素互相交织、复杂多变，目前耐药机制研究尚浅，需进一步探索，以期提高抗血管治疗疗效。

3 抗血管生成治疗相关耐药标志物

耐药预测标志物对预测耐药、调整治疗方案、发现新靶点有指导作用。VEGF对新生血管形成及肿瘤生长和转移起着重要作用，我们推测血浆、组织中VEGF水平可能成为抗血管生成疗效的理想标志物，但研究结果存在很大争议。有临床研究显示，循环中的VEGF基线水平与总反应率(overall reaction rate)有一定关联，但与预测OS不相关［39］。在贝伐单抗治疗转移性乳腺癌的研究发现，基线血浆VEGF水平与治疗疗效无关［40］。因此，VEGF并不是理想的疗效标志物。由耐药机制可知，许多循环血管生成因子、细胞与耐药性存在一定关联如:FGF、PDGF、PLGF、SDF-1、Ang、TNF-α、循环祖细胞(circulating progenitor cells，CPCs)及循环内皮细胞(circulating endothelial cells，CECs)等，它们与肿瘤血管发生、发展有着密切关系，可能对血管生成抑制剂疗效的预测有重要作用。属于TKI的西地尼布(cediranib)治疗复发恶性胶质瘤时，血浆的循环祖细胞、循环内皮细胞、成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)及SDF-1α水平高的患者，其肿瘤复发及转移力增强［41］。贝伐单抗可以减少血管内皮细胞中一氧化氮(nitric oxide，NO)的合成致血管收缩使血压升高，血压升高可能成为抗血管生成药物疗效的预测指标［42］。循环中的促血管生成因子、细胞与血压升高有望成为抗血管生成治疗疗效的指标，但其是否能成为肿瘤疗效指标，如何指导我们联合用药需要深入研究。

4 结语

目前，抗血管生成耐药现象得到越来越多的研究证实，对耐药机制的研究尚不深入，加强研究，有助于克服耐药，并利于研发新药、指导临床用药。绝大多数肿瘤表达的促血管生成因子有所不同，间接血管生成抑制剂阻断其中一个或几个因子则会启动替代性生成因子，激活相应血管生成信号通路，导致肿瘤产生耐药。直接的血管生成抑制剂直接作用于内皮细胞，避免了因抑制单一信号传导通路引起的其它血管生成信号通路的激活。有学者提出，间接血管生成抑制剂比直接抑制剂更容易出现耐药，应重点开发直接抑制剂，且二者联合用药可能会增加疗效。开发多靶点药物及联合用药可能会逆转或延缓耐药性。浸润于肿瘤组织中的髓系细胞能够促进血管生成、加速肿瘤发展，从而降低了临床肿瘤治疗的疗效，那么抗血管生成治疗的同时，联合删除肿瘤中的髓系细胞或阻断其促进肿瘤血管生成作用，可能会有效地抑制肿瘤复发［43］。化疗药物缓释给药取得良好效果，抗血管生成药物采用缓释系统如纳米粒、微球等缓慢给药能否提高疗效和克服耐药值得研究。另外，研究特异性标志物来预测耐药情况以指导用药，循环中血管生成因子、细胞有望成为预测抗血管生成耐药指标，但需要更多的研究来确证。

抗血管生成耐药机制是什么，如何克服、逆转耐药，怎样预测耐药等一系列问题都值得我们深入思考与探讨。随着研究的深入，耐药机制会逐渐被阐明，抗血管生成治疗效果将会不断提高，从而改善肿瘤患者PFS、OS并提高其生活质量(quality of life，QOL)。

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