大鼠脑损伤后血浆E T-1的含量变化与损伤时间的关系

王 茝

山西医科大学法医学院，山西太原 030001

随着经济、社会、及交通等各方面的发展，脑损伤的发生率呈不断上升趋势，脑损伤也成为国内外法医学研究的主要死因之一。内皮素（Endothelin）是上世纪80年代由日本学者Yanagisaw等[1]从猪主动脉内皮细胞分离出的一种活性肽，是迄今研究人体内最强的缩血管物质之一。ET-1是内皮素家族中含量最多而且功能最主要的一种。本实验参照Feeney's法建立大鼠脑损伤模型，应用酶联免疫法检测大鼠脑损伤后不同时间点ET-1的表达规律。为法医学脑损伤的推断及研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

2013年11月—12月，选取健康成年SD大鼠40只，雌雄不限，体重250g～300g,随机分为正常组，假损伤对照组和脑损伤组1h、6h、24h、48h、3d、7d 共 8 组，每组 5 只。

1.2 动物模型制备

参照Feeney's法[2]建立大鼠脑损伤模型，大鼠称重后，以10%水合氯醛进行腹腔麻醉，采取俯卧位固定于打击台上，将大鼠顶枕部常规消毒备皮，于正中线处将头皮切约4 cm切口，剥离骨膜，以人字缝前3 mm，颅骨正中线旁3 mm处用骨钻钻一直径约为5 mm的圆形骨窗，使硬脑膜充分暴露，并保持完好，自制一打击垫放入骨窗，模拟自由落体打击装置，以50 g砝码沿导管于40 cm高处落下打击骨窗处，观察片刻后以骨腊封闭骨窗，缝合头皮。正常组不做任何处理，对照组SD大鼠仅做钻孔处理，不做自由落体打击，不致脑损伤。遂将大鼠置于室内安静、清洁的鼠笼中进行正常饲养，然后依据实验设计损伤时间点取材。

1.3 ET-1的测定

脑损伤组按损伤时间后 1h、6h、24h、48h、3d及 7d时间点进行10%水合氯醛麻醉，采血4 mL,将4 mL血液标本加入10%EDTA 60 uL和 80 uL抑肽酶,混合20 min后，3000转/分离心 20 min，分离血浆后，严格按照（ET-1）ELISA试剂盒说明书操作，测血浆内皮素-1含量。

1.4 数据统计学分析

本实验全部数据采用SPSS统计软件处理分析，计量数据结果描述均以均数±标准差（±s）表示，采用t检验进行统计分析。P<0.05表示有统计学意义。

2 结果

脑损伤组大鼠血浆ET-1含量在损伤后1h与假损伤对照组相比明显升高，有统计学意义(P<0.05)。其在损伤后24h内呈持续升高状态。24h血浆ET-1含量水平达到高峰，随后逐渐下降，3d时仍高于对照组，并且有统计学意义（P<0.05）.至7d时，血浆ET-1含量趋于正常组，无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 ELISA法测定正常组，假损伤对照组及损伤后不同时间的血浆ET-1 含量（±s）The ET-1 level in plasma between each groups by ELISA

表1 ELISA法测定正常组，假损伤对照组及损伤后不同时间的血浆ET-1 含量（±s）The ET-1 level in plasma between each groups by ELISA

注：与对照组比较有统计学意义，*P<0.05。

组别（n=5） 血浆 ET-1（pg/mL）正常组假损伤对照组损伤后1h组损伤后6h组损伤后24h组损伤后48h组损伤后3d组损伤后7d组40.16±1.47 46.24±2.93 65.68±3.02*80.49±8.26*102.29±15.82*68.46±10.24*56.63±5.48*43.22±2.05

3 讨论

ET是由21种氨基酸组成的活性肽物质，是目前已知体内最强的缩血管物质。ET-1是唯一存在于血管内皮细胞的内皮素。ET-1是内皮素家族中含量最多而且功能最主要的一种。目前，还没有研究发现在生理条件下内皮细胞可以释放ET，但在化学或是机械刺激下对ET的合成有诱导作用。

本实验结果显示大鼠于脑损伤1h后ET-1表达即明显增强，24h达到高峰，48h开始下降，提示ET-1参与了颅脑损伤的过程。颅脑损伤后ET-1含量增高的机制尚不完全明确，其原因可能有：①脑损伤后引发机体产生应激反应，使肾上腺素分泌增加，诱导ET-1的合成[3]。②脑损伤后血管内皮受损，刺激血小板粘附，血栓形成，红细胞破坏释放出氧合血红蛋白，可刺激血管内皮产生ET-1[4]。③脑损伤后，引发脑水肿，颅内压升高，脑组织血流灌注量降低，脑缺血，缺氧状态下可诱发血管内皮释放ET-1[5]。④中枢神经系统应激反应，内包括内皮细胞，神经元，胶质细胞等释放ET-1。⑤脑损伤后，局部缺血，或是出血，凝血酶增加，也可导致ET-1的释放。⑥机体应激反应下，交感神经兴奋使肾上腺皮质激素分泌增加刺激外周血管内皮细胞释放ET-1。本实验结果与段国贤等[6]研究内皮素-1在大鼠弥漫性脑损伤时的改变结果有所差异，其模型鼠伤后3h血浆ET-1含量增加，6h达高峰，24h开始下降。差异的存在可能与实验标本的选取、损伤方式的不同及损伤程度有关。

近年来，有关ET-1的研究有很多，但ET-1与损伤时间之间的关联性研究却鲜有涉及，本实验结果显示随着损伤时间的不同，ET-1含量的表达程度不同，表明血浆ET-1的表达与损伤时间有一定关联性。为法医实践工作中损伤时间的推断提供了参考依据。但由于动物实验存在多种不可抗拒因素和样本的局限性，统计学上可能存在误差。所以与实际运用还存在着差距。在今后的研究中，应结合临床，以及脑损伤程度的分级来加以研究，总之，血浆ET-1用于法医学实践中，还有待进一步的探索和研究。

[1]Yanagisawa M，Kurihara H，Kimura S，et al.A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cell[J].Nature，1988,332:411-415.

[2]Feeney DM,Boyeson MG,Linn RT,et al.Responses to cortical injury Methodology and local effect of contusions in the rat[J].Brain Res,1981,211:67-77.

[3]Miyauchi T,Yanagisawa M,Tomizawa T，et al.Increased plasma concentrations of ET-1 and big ET-1 in acute myocardial plasma infarction[J].Lancet，1989（2）:53-54.

[4]陶进,李真保,许安定.血浆内皮素的变化与颅脑损伤程度及预后关系[J].急诊医学，2009,9(2):101-102.

[5]Highsmith RF,Pang DC,Rappoport RM,et al.Endothelia cell-derived vasoconstrictors,mechanism of action in vascular smooth muscle.[J].Cardiovasc Pharmacol，1989，13(5):36-44.

[6]段国贤，周开顺.内皮素-1在大鼠弥漫性脑损伤时的改变和意义.[J]临床神经病学杂志，2003，16(3):179-180.