头痛宁胶囊对偏头痛大鼠中脑降钙素基因相关肽表达的影响

姚 刚 赵继福 黄 倩 于挺敏▲

1.吉林大学第二医院神经内科，吉林长春 130041；2.长春市中医院内科，吉林长春 130022

降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP） 是内源性痛觉调制系统中重要的中介物质， 拮抗和减弱内源性阿片肽在中脑的镇痛效应，参与调节内源性痛觉调制系统的功能[1-2]。头痛宁胶囊对多种慢性头痛（如偏头痛、紧张型头痛等）均有较为满意的疗效[3-4]。 该药对内源性痛觉调制系统的关键结构——中脑CGRP 的表达是否产生影响目前尚无相关研究。本实验通过观察头痛宁胶囊对偏头痛模型大鼠中脑CGRP mRNA 表达的影响，探讨该药对偏头痛的治疗机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

头痛宁胶囊（咸阳步长制药有限公司）；硝酸甘油注射剂（山西康宝生物制品股份有限公司）；RNAiso Reagent、RNA PCR Kit （AMV）Ver.3.0、E.coli DH5α、pEASY-T1 Vector、限制酶BamH Ⅰ和EcoR Ⅴ、SYBR Premix Ex TaqTM均购自大连TaKaRa 公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 及AxyPrep Plasmid Miniprep Kit购自Axygen Biosciences 公司；其他试剂均为国产分析纯。PCR 仪（Perkin Elmer GeneAmp PCR system2400）；台式冷冻离心机（MIKRO 22R zentrifugen）；超低温冰箱（MDF-382E）；Sub-Cell GT（Agarose Gel Electrophoresis Systems，BIO-RAD）；BIO-RAD Power PAC 200/300稳压稳流电泳仪；凝胶成像系统（Kada）；紫外分光光度计（UV-2401PC，Shimadzu），软件：UVPC version 3.9；定量PCR 仪（ABI PRISM 7500）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物、分组、药物干预、造模

健康Wistar 大鼠24 只，雌雄各半，200～220 g，由吉林大学基础医学院动物中心提供。 24 只健康成年Wistar 大鼠，随机分为4 组：对照组（A 组），偏头痛组（B 组），头痛宁胶囊对照组（C 组），头痛宁胶囊治疗组（D 组），每组6 只。 根据成人每日口服剂量换算得到实验大鼠给药剂量，头痛宁胶囊对照组和头痛宁胶囊治疗组给予头痛宁胶囊0.375 g/（kg·d）灌胃，对照组、偏头痛组给予生理盐水2 mL/d 灌胃给药，连续给药7 d 后， 偏头痛组和头痛宁胶囊对照组大鼠制备偏头痛大鼠模型 （臀部皮下注射硝酸甘油注射剂10 mg/kg），以造模大鼠出现爬笼次数增多、前肢频繁搔头、往返运动、咬尾等不适的症状为造模成功的指标[6]。 对照组和头痛宁胶囊对照组大鼠皮下注射生理盐水2 mL/kg。

1.2.2 标本采集

造模2 h 时10%水合氯醛麻醉大鼠（0.3 mL/100 g），取脑，分离中脑，-70℃保存。

1.2.3 实时定量PCR

1.2.3.1 cDNA 合成 按RNA 提取试剂盒说明书提取各组大鼠中脑总RNA。 MgCl24 μL， RNase Inhibitor 0.5 μL， AMV Reverse Transcriptase 1 μL，5×RT Buffer 4 μL，dNTP Mixture （各10 mmol/L）2 μL，Random 9 mers 1 μL， 总RNA 250 ng， 以及RNase Free dH2O，总体积为20 μL。 逆转录反应条件：30℃10 min，42℃30 min，99℃5 min，5℃5 min。

1.2.3.2 标准品制备 CGRP 引物上游5'-AAGTTCTCCCCTTTCCTGGT-3'，下游5'-GGTGGGCACAAAGTTG TCCT-3'。 PCR 扩增反应条件：变性（94℃30s），退火（53℃30 s），延伸（72℃30 s），35 个循环。 试剂盒回收、纯化PCR 扩增的目的基因，与pEASY-T1 载体连接，之后转化到E.coli DH5α 中，氨苄青霉素筛选，试剂盒提取质粒，限制酶BamH Ⅰ、EcoR Ⅴ双酶切鉴定及测序，证实CGRP cDNA 全长完全正确。 计算所提取质粒的拷贝数（测OD260值），作为标准品（无菌水10 倍系列稀释后分装），-20℃保存。

1.2.3.3 SYBR GreenⅠ实时定量PCR SYBR Premix ExTaqTM10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL， 上下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），cDNA 标本2.0 μL，dH2O 6.8 μL，总反应体系为20 μL。 10 倍系列稀释的标准品，同时进行PCR 扩增。各标本均做3 个复孔。反应条件：变性（94℃30 s），退火（53℃30 s），延伸（72℃30 s），共40个循环。 同时进行熔解曲线分析，分析模式：95℃15 s，60℃20 s，95℃15 s。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计学软件进行数据分析， 计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，组间差别采用单因素方差分析和Tukey 比较，以P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CGRP 质粒标准品

采用普通PCR 获得CGRP 基因扩增产物，纯化回收，与pEASY-T1 载体连接成为重组质粒（标准品），质粒标准品经过双酶切鉴定与预期结果一致，测序结果回报所克隆序列同靶基因序列的同源性达100%。

2.2 CGRP 标准品实时定量PCR 标准曲线

利用10 倍系列稀释的CGRP 质粒标准品制作PCR 标准曲线。 基因检测的下限为2.7×103拷贝/μL，检测的上限为2.7×109拷贝/μL， 回归方程Ct=-2.69Log（x）+38.875，r=0.993，线性范围达7 个数量级（图1）。

图1 降钙素基因相关肽基因标准品实时定量PCR 标准曲线

2.3 产物特异性

熔解曲线分析结果显示，10 倍系列稀释的CGRP质粒标准品PCR 产物熔解曲线峰值均在88℃， 峰形锐利，说明产物特异。

2.4 各组大鼠中脑CGRP mRNA 表达量

根据标准曲线，计算机可直接计算出各标本模板的CGRP mRNA 初始含量（图2）。各标本PCR 扩增产物熔解曲线峰值也在88℃，说明产物特异。 各组大鼠中脑每250 ng 总RNA 中脑CGRP mRNA 拷贝数分别为（1.13±0.68）×104、（1.61±0.51）×104、（0.80±0.45）×104、（0.75±0.27）×104。 A、B 组大鼠中脑CGRP mRNA拷贝数比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）；C、D 组大鼠中脑CGRP mRNA 拷贝数，差异无统计学意义（P ＞0.05）；C、D 组大鼠中脑CGRP mRNA 拷贝数比较，明显低于B 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。

图2 各组大鼠中脑CGRP mRNA 表达情况

3 讨论

头痛宁胶囊由天麻、土茯苓、制何首乌、防风、全蝎、当归六味药材按照GMP 标准严格生产的中成药制剂。 多数单药组分具有镇痛作用，天麻具有镇静、安神、减轻头痛等作用[7]。 动物实验发现，土茯苓能明显提高小鼠的热板痛阈值[8]。 当归的抗氧化和抗自由基效应，起到神经保护的作用[9]。 全蝎中含有的蝎毒多肽具有很强的镇痛作用。 有研究发现：头痛宁胶囊可以上调偏头痛大鼠中脑脑啡肽原mRNA 的表达，进而增加与内源性镇痛直接相关的两种脑啡肽 （甲硫氨酸脑啡肽和亮氨酸脑啡肽）在中脑的含量，说明头痛宁胶囊对内源性痛觉调制系统的功能发挥调节作用[10]。

内源性痛觉调制系统的核心结构是中脑导水管周围灰质（periaqueductal gray，PAG），凡是由激活更高中枢所产生的镇痛效应， 大部分都被证明是通过PAG 才得以实现的， 这充分体现了PAG 在痛觉调制中的重要性[11-12]。 PAG 与延髓头端腹内侧网状结构相连接，调节脊髓背角的痛觉初级传入活动，这一过程通过下行抑制通路得以实现。 CGRP 作为内源性痛觉调制系统中重要的中介物质，参与疼痛与镇痛过程。

本研究以头痛宁胶囊为干预因素，观察其对硝酸甘油型偏头痛大鼠中脑CGRP 表达的影响，进一步观察头痛宁胶囊对内源性痛觉调制系统的调节作用，探讨其治疗偏头痛的中枢机制。本实验建立的检测大鼠CGRP 基因的实时定量PCR 方法，具有很高的敏感性和重复性，使得实验结果精确可靠。实验结果发现：以头痛宁胶囊作为干预因素的偏头痛大鼠， 其中脑CGRP mRNA 表达明显低于偏头痛模型大鼠，说明头痛宁胶囊对偏头痛大鼠中脑CGRP 基因表达具有抑制作用。

CGRP 与偏头痛关系极为密切，在外周，CGRP 是最有效的血管扩张肽[13]，CGRP 与位于脑血管平滑肌的CGRP 受体结合导致脑血管异常扩张[14-15]，引发头痛。三叉神经血管末梢释放的CGRP 可触发脑膜肥大细胞脱颗粒，进而引发一系列生物学反应，诱发脑膜神经源性炎症[16]，导致头痛发生。 除此以外，CGRP 还是三叉神经脊束核中伤害性感受神经元的神经调质[17]，传递痛觉信息。 在中脑，CGRP 的主要作用是拮抗内源性阿片肽的镇痛效应[18]。 本研究发现头痛宁胶囊可以下调偏头痛大鼠中脑CGRP 的基因表达，由此认为头痛宁胶囊治疗偏头痛的机制与其抑制中脑CGRP的表达有关。

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