干扰素α通过P204和P21诱导大鼠原代血管平滑肌细胞凋亡

龙向淑，吴 强，宋 方，黄 晶，张林军

(贵州省人民医院 心血管内科， 贵州 贵阳 550002)

细胞凋亡、增殖及分化等均是维持生物体动态平衡必需的细胞活动。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)增殖增多及凋亡减少是高血压、动脉粥样硬化及血管成形术后再狭窄等血管增殖性疾病的主要发病机制。干扰素(interferon，IFN)与相应受体结合，诱导一系列IFN刺激反应基因(IFN stimulated genes，ISGs)表达而发挥其抗病毒、免疫调节、抑制细胞增殖及促进细胞凋亡等作用[1- 3]。P204是IFN诱导蛋白P200家族的鼠类蛋白成员，研究显示，IFN-α可诱导P204表达而抑制大鼠VSMCs及血管外膜成纤维细胞增殖[4- 6]，P21表达变化与P204呈一致性趋势，提示P21可能参与P204对VSMCs增殖的调控[4]。研究发现，IFN可诱导肿瘤及病毒感染细胞凋亡[1- 2]，但IFN对VSMCs凋亡的影响及其机制尚未见文献报道。本研究用IFN-α和/或P204 siRNA处理大鼠原代VSMCs，观察VSMCs凋亡及P204和P21表达的变化，为IFN及ISGs在血管增殖性疾病领域的应用提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂(盒)

清洁级SD大鼠(雌性1只，雄性2只)，年龄约5周龄，体质量120 ～140 g[第三军医大学实验动物中心，合格证号：SCXK(渝)2012- 0003]。IFN-α(北京三元基因工程有限公司)；DMEM高糖型细胞培养液和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(均Hyclone公司)；α-SMA单克隆抗体(BM0002)、即用型SABC试剂盒和DAB显色试剂盒(均武汉博士德公司)；四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT](Sigma 公司)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(C1063)和Tubulin抗体(碧云天公司)；Trizol总RNA提取试剂(DP405)、2×Taq PCR MasterMix(KT201)和100 bp DNA Ladder(均北京天根公司)；RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)；PCR扩增引物由宝生物工程有限公司合成(大连)(表1)；P204抗体(Santa Cruz公司)；p21抗体(ab92675)(Abcam公司)。

表1 引物序列Table 1 The sequences of primers

1.2 细胞培养及实验分组

按文献[7]的方法培养VSMCs。取4～6代细胞用于实验。实验分4组：非特异性siRNA转染组设为对照组(control)、IFN-α干预组(IFN)、IFI204 siRNA转染组及IFI204 siRNA转染+IFN-α干预组(siRNA+ IFN)。IFN组用终浓度为2×106U/L IFN-α干预6 h，siRNA组瞬时转染IFI204 siRNA干预6 h，siRNA+IFN组先瞬时转染IFI204 siRNA干预6 h，后与IFN组同步加IFN-α干预6 h，继续培养48 h收集细胞。实验重复3次。

1.3 RT-PCR检测mRNA表达

按Trizol 总RNA提取试剂盒说明提取总RNA，取1 μg 按RT-PCR试剂盒说明书反转录合成cDNA，取产物3 μL进行PCR循环，PCR扩增条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，扩增30个循环，最后72℃ 延伸5 min。反应结束后取PCR产物5 μL在2%琼脂糖凝胶中电泳分析，UVP800型凝胶成像系统成像。

1.4 Western blot检测蛋白表达

按文献[8]的方法检测蛋白表达。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

按Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(C1063)说明书检测细胞凋亡。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 干预因素对P204 mRNA和蛋白表达的影响

与对照组比较，IFN组P204 mRNA和蛋白表达增加，siRNA组P204 mRNA和蛋白表达减少，siRNA+IFN组P204 mRNA和蛋白表达减少(P<0.01)；与IFN组比较，siRNA组及siRNA+IFN组P204 mRNA和蛋白表达减少(P<0.01)(图1，表2)。

2.2 IFN-α对VSMCs凋亡的影响

与对照组比较，IFN组细胞凋亡增多，siRNA组细胞凋亡减少，siRNA+IFN组细胞凋亡增多(P<0.01)；与IFN组比较，siRNA组细胞凋亡减少(P<0.01)；与siRNA组比较，siRNA+IFN组细胞凋亡增多(P<0.01)(图2，表2)。

2.3 干预因素对P21 mRNA和蛋白表达的影响

与对照组比较，IFN组P21 mRNA及蛋白表达增加，siRNA组P21 mRNA及蛋白表达减少，siRNA+IFN组P21 mRNA及蛋白表达增加(P<0.01)；与IFN组比较，siRNA组P21 mRNA及蛋白表达减少(P<0.01)；与siRNA组比较，siRNA+IFN组P21 mRNA及蛋白表达增加(P<0.01)(图3，表2)。

control.control group; IFN.IFN-α induction group; siRNA.siRNA transfaction group; siRNA+IFN.IFI204 siRNA transfaction and IFN-α induction group图1 干预因素对大鼠VSMCs P204 mRNA及 蛋白表达的影响Fig 1 Effect of intervention factor on expression of P204 mRNA and protein in VSMCs in rats

control.control group; IFN.IFN-α induction group; siRNA.siRNA transfaction group; siRNA+IFN.IFI204 siRNA transfaction and IFN-α induction group

图2 干预因素对大鼠VSMCs凋亡的影响Fig 2 Effect of intervention factor on cell apoptosis in VSMCs of rats

▲P<0.01 compared with control;*P<0.01 compared with IFN group；#P<0.01compared with siRNA group.

control.control group; IFN.IFN-α induction group; siRNA.siRNA transfaction group; siRNA+IFN.IFI204 siRNA transfaction and IFN-α induction group图3 干预因素对大鼠VSMCs P21mRNA及蛋白 表达的影响Fig 3 Effect of intervention factor on expression of P21 mRNA and protein in VSMCs in rats

3 讨论

物理损伤、化学刺激及炎性反应等因素导致VSMCs过度增殖而凋亡减少是高血压、动脉粥样硬化及血管成形术后再狭窄等血管增殖性疾病发生、发展的重要机制，因此，有效促进VSMCs凋亡是防治上述疾病的措施之一。

IFN与相应受体结合诱导一系列蛋白表达而发挥其抗病毒、影响细胞生长和分化、调节免疫应答及抑制肿瘤细胞，如肝癌细胞转移等功能[1- 2, 9- 11]。P204是IFN诱导蛋白P200家族的鼠类蛋白成员之一，IFN-α可促进P204表达而抑制大鼠VSMCs增殖及其部分机制已明确[4- 5]，但IFN-α对VSMCs凋亡有何影响？本结果显示， IFN-α干预后P204 mRNA和蛋白表达上调，导致VSMCs凋亡增加，进一步证实P204表达存在转录和翻译水平的IFN-α诱导性，提示IFN-α可诱导P204表达而促进VSMCs凋亡。P21是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子的CIP/KIP家族成员，其启动子上有P53的结合位点，是P53调节转录的靶基因。P53能促进细胞凋亡相关分子，如Apaf- 1、Bax、Noxa和PUMA等的表达，增强细胞对凋亡刺激的敏感性而导致细胞凋亡[12]。本研究表明，单纯IFN-α干预可诱导P204 mRNA和蛋白表达上调，伴P21 mRNA及蛋白表达增多，促进VSMCs凋亡；转染IFI204 siRNA后P204 mRNA和蛋白表达下调，P21 mRNA及蛋白表达亦下调，VSMCs凋亡减少，提示P21表达变化与P204呈一致性趋势，在IFN-α促进VSMCs凋亡过程中，P21可能作为P204的下游蛋白而发挥其作用。除P204途径外，是否尚存在IFN-α影响VSMCs P21表达的其他机制？本研究证实，转染IFI204 siRNA后再加IFN-α干预，P204 mRNA和蛋白表达减少，而P21 mRNA及蛋白表达上调，细胞凋亡增多，提示抑制VSMCs P204表达对IFN-α上调P21表达及促进VSMCs凋亡的作用无明显影响，除P204途径外，IFN-α尚存在影响VSMCs P21表达的其他机制。

综上所述，IFN-α可诱导VSMCs凋亡，该效应可能与IFN-α促进P204及P21表达有关，P204是作为P21的上游蛋白而发挥其作用，P204途径仅为IFN-α影响P21表达调控VSMCs凋亡的机制之一。

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