达托霉素发酵培养基配方及30L罐工艺优化

王秀琴，钱思宇，贾啸静，娄 忻，仲伟潭，时 蕾

（华北制药集团新药研究开发有限责任公司 微生物药物国家工程研究中心河北省工业微生物代谢工程技术研究中心，河北 石家庄050015）

达托霉素是一种能有效作用于耐药菌的新型抗生素，通过阻碍细菌细胞壁的生成和破坏细菌细胞膜的功能等方式达到杀菌的目的。与传统抗生素相比，达托霉素作用机制独特，且不易产生耐药菌［1－2］，临床上对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐万古霉素金黄色葡萄球菌（VRSA）、耐万古霉素肠球菌（VRE）、凝固酶阴性的葡萄球菌（CNS）等顽固耐药菌有较强活性［3－4］，已成为近年来医药界的研究热点，取得了显著的成果［5－8］。

达托霉素产生菌为玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus）。作者采用均匀设计法对前期筛选的高产菌种的发酵培养基进行优化，所得的最优配方经过连续5批的重复实验验证，再将该配方进行30L发酵罐放大，通过调整发酵参数对关键工艺进行了优化。

1 实验

1.1 菌株、培养基与仪器

玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus）NU－1030，由微生物药物国家工程研究中心菌种保藏库提供。

种子培养基：糊精1%，葡萄糖0.5%，玉米浆0.5%，K2HPO4·3H2O 0.04%，MgSO4·7H2O 0.1%。

发酵培养基（以下称“配方一”）：葡萄糖2%，淀粉1.3%，冷榨豆饼粉1.5%，蛋白胨1%，CaCO30.5%，MgSO4·7H2O 0.3%，前体癸酸钠（癸酸与NaOH等摩尔耦合）0.8%。

摇床，美国NBS公司；超净台、离心机，国产；30L发酵罐，德国贝朗公司。

1.2 培养方法

1.2.1 摇瓶培养

种子培养：取生长好的斜面，用接种铲挖块1cm2左右接入种子瓶中，于28℃、220r·min－1培养36h。

发酵培养：将摇瓶种子按4%的接种量接入250 mL装量为40mL的发酵瓶中，于28℃、220r·min－1培养118h。

1.2.2 30L发酵罐放大

将摇瓶种子按8%接种量接入30L发酵罐中，温度（27±1）℃，罐压0.05MPa，空气流量1∶1.2，搅拌速度300r·min－1。前体癸酸钠的补料总量为0.8%，采取流加补料方式，发酵32h开始补料，至发酵结束前12h完成，发酵周期168h。

1.3 检测方法

采用HPLC法［9］进行检测。

2 结果与讨论

2.1 摇瓶发酵培养基配方优化

以配方一为对照，选取葡萄糖（X1）、淀粉（X2）、冷榨豆饼粉（X3）和蛋白胨（X4）为考察因素，以相对发酵效价为考核指标，进行4因素4水平U8（84）均匀设计实验以优化摇瓶发酵培养基配方，设计方案及结果见表1。

表1 均匀设计实验方案及结果／%Tab.1 Experimental scheme and results of uniform design／%

采用均匀设计软件V4.0对表1结果进行最优回归子集分析，得到相对发酵效价（Y）对葡萄糖（X1）、淀粉（X2）、冷榨豆饼粉（X3）、蛋白胨（X4）4个因素的回归方程为：Y＝65.8＋39.2 X1－62.4 X3－11.5 X1X2＋23.8 X－7.5 X2X3＋24.1 X，R2＝0.9997，s＝0.8155。

对回归方程各项参数的方差分析结果见表2。

表2 回归方程的方差分析Tab.2 Variance analysis of regression equation

最优发酵培养基配方为：葡萄糖（X1）2.0%、淀粉（X2）2.0%、冷榨豆饼粉（X3）0.5%、蛋白胨（X4）0.6%，相对发酵效价为160.7724%。

查表得F0.05（6，2）＝19.33，F值远远大于F0.05（6，2），均方和P值都合理，说明方程拟合度好，方程有极其显著的意义，所得最优配方有实际参考价值。

按最优发酵培养基配方连续进行5批摇瓶验证实验，每批做5个平行，取平均值，以配方一为对照（发酵效价设为100%）。5批摇瓶验证实验的相对发酵效价分别为167%、172%、159%、161%、158%，平均为163%，较配方一高出63%。

2.2 30L发酵罐放大实验及工艺优化

2.2.1 最优配方30L发酵罐放大实验

按最优配方进行30L发酵罐放大实验。以配方一为对照（发酵效价设为100%），连续5批的相对发酵效价分别为121%、132%、125%、135%、126%，平均为128%，较配方一高出28%。

菌种进罐24h后开始监测菌丝量，每4h测一次。两种配方下菌丝量随发酵时间的变化见图1。

图1 两种配方下菌丝量随发酵时间的变化Fig.1 Changes of hyphae quantities with time in the two mediums

从图1可以看出，最优配方进罐罐批的初始菌丝量高于配方一进罐的罐批，菌丝量达到最大值的时间也相对提前，同期的菌丝量也相对较高。

2.2.2 前体癸酸钠补料起始时间与补料总量优化

为进一步优化工艺条件，对前体癸酸钠的补料起始时间进行了考察，结果见表3。

表3 前体补料起始时间的确定Tab.3 Determination of the initial feeding time of precurson

由表3可知，在发酵28h时补加前体癸酸钠，相对发酵效价比原补料方案（32h时开始补料）显著提高。说明按优化配方进罐，在发酵28h时开始补加前体更有利于目的产物的形成。因此，确定前体癸酸钠的补料起始时间为发酵开始28h。

前体癸酸钠补料总量对相对发酵效价的影响见表4。

表4 前体补料总量的确定Tab.4 Determination of total feeding amount of precurson

由表4可知，前体癸酸钠的补料总量从0.8%提高到1.5%时，相对发酵效价大幅提升。说明前体癸酸钠补料总量为1.5%最为适宜，太少不足以提供达托霉素生成所需的侧链供应，太多则会对菌体生长产生毒害，也不利于菌体的次级代谢。

综上，确定达托霉素30L罐发酵工艺中前体癸酸钠的补料起始时间为发酵开始28h，补料总量为1.5%。

2.2.3 最优配方及工艺验证实验

按最优配方及调整后的新工艺连续进行5批30L发酵罐放大实验，结果稳定，相对发酵效价分别为178%、185%、192%、171%、180%，平均为181%，较配方一高出81%。

3 结论

采用均匀设计法优化达托霉素最优发酵培养基配方为：葡萄糖2.0%、淀粉2.0%、冷榨豆饼粉0.5%、蛋白胨0.6%。将优化配方于30L发酵罐放大并对发酵工艺进行了优化，优化的发酵工艺为：前体癸酸钠的补料起始时间为发酵开始28h，补料总量为1.5%。优化后的工艺和配方的发酵效价较对照提高81%，对达托霉素的工业化生产具有指导意义。

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