合欢皮总皂苷对人微血管内皮细胞体外增殖的影响

冯 磊，谭 莹，陈 爽，邱丽颖*，金 坚

1江南大学无锡医学院;2 江南大学药学院，无锡 214122

合欢属Albizzia 为豆科含羞草亚科植物［1］，是Albizzia julibrissin Durazz 的树皮［2］，具有解郁安神、活血消肿之功效。已有文献报道合欢皮乙醇粗提物在体内明显抑制血管生成，阻止肿瘤细胞生长、侵袭和迁移，同时存在一定的毒性作用［3-9］。本文通过制备合欢皮总皂苷，考察其对人微血管内皮细胞(HMEC-1)增殖的抑制作用，细胞形态学变化、细胞周期分布改变，初步探讨其抑制细胞增殖的机制。

1 材料与仪器

1.1 细胞株

实验所用细胞株为SV40 猿猴空泡病毒转染人脐静脉微血管内皮细胞HMEC-1(Human Microvascular Endothelial Cells)，由法国国家卫生医药研究院U553 研究所提供。

1.2 药物与试剂

合欢皮为豆科植物合欢Albizzia julibrissin Durazz 的干燥树皮，购自无锡山禾集团健康参药连锁有限公司，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定，符合《中华人民共和国药典》2010 版标准［10］;细胞全基因DNA 抽提试剂盒，购自北京天根生物技术有限公司;SRB、PI 均购自美国Sigma 公司。

1.3 主要仪器

SY18-WJ2/3 型CO2细胞培养箱(美国赛默飞世尔科技公司);SW-CJ-IF 超净工作台(江苏苏净集团安泰公司);Multiskan MK3 自动酶标仪(美国赛默飞世尔科技公司);BX40 显微镜(Olympus 公司);FAC SCIalibur 流式细胞仪(美国BD 公司)。

2 实验方法

2.1 合欢皮总皂苷样品的制备

称取合欢皮，加入60 倍70%乙醇，加热回流提取2 次，每次2.5 h，过滤，合并滤液，得提取液;提取液减压回收乙醇并冷冻干燥;取合欢皮提取物冻干粉经D101 大孔树脂分离，依次用蒸馏水及30%、70%乙醇冲洗。收集70%乙醇洗脱馏分，减压回收乙醇，冷冻干燥得合欢皮总皂苷粉末，并分析其干物质量及总皂苷含量。

2.2 人微血管内皮细胞形态的观察及增殖的测定

按常规于37 ℃、5% CO2培养箱以10%的小牛血清传代培养HMEC-1 细胞，试验时将细胞以8 ×103个/孔接种于96 孔板，生长至对数期后同步化培养24 h。取合欢皮总皂苷冻干粉，以全培养基分别配制至终浓度为1.0、1.5、2.0 μg/mL 作为加样组，分别作用细胞48、72 h，采用光学显微镜观察细胞形态变化。药物作用结束后，选用磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B，SRB)比色法，去上清，每孔加入100 g/L 三氯醋酸100 μL 固定，静置5 min 后移到4℃再放置至40 min，倾掉固定液，用去离子水洗5遍，空气干燥，每孔加入4 g/L SRB 100 μL 室温放置30 min，用10 ml/L 醋酸液洗5 遍，加入150 μL 10 mmol/L Tris 碱液(pH 10.5)溶解，在540 nm 波长下用酶标仪测定光密度值OD。以阴性组(不加合欢皮总皂苷干预，显色为正常细胞与试剂反应)和空白组(不加任何物质，显色为试剂反应)为对照，按以下公式计算合欢皮总皂苷对HMEC-1 细胞生长的抑制率。

2.3 台盼蓝染色观察人微血管内皮细胞膜通透性

取对数期细胞经同步化培养24 h，按“2.2”项所述步骤加入不同浓度的合欢皮总皂苷，继续在37 ℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养48 h 或72 h，消化收集细胞(包括漂浮细胞)，1000 rpm 离心5 min，弃去培养基，PBS 重悬并调整细胞浓度至5 ×104个/mL。加入0.2%台盼蓝溶液，滴在载玻片上，以阴性组(不加合欢皮总皂苷干预)为对照进行观察。

2.4 DNA Ladder 观察人微血管内皮细胞凋亡

采用DNA 梯形条带(DNA Ladder)法，对数期细胞经同步化培养24 h，按“2.3”项所述步骤收集不同浓度的合欢皮总皂苷作用后的细胞，按细胞全基因组DNA 提取试剂盒步骤说明，提取细胞全基因组的DNA，4 ℃冰箱备用。制备1.8%琼脂糖凝胶，60 V 电泳1 h，用紫外投射仪观察梯形条带，并摄影，以阴性组(不加合欢皮总皂苷干预)为对照进行观察。

2.5 流式细胞仪分析人微血管内皮细胞周期

取对数期细胞经同步化培养24 h，按“2.3”项所述步骤收集不同浓度的合欢皮总皂苷作用后的细胞，1000 rpm 离心5 min，弃去培养基，PBS 漂洗2次，在终浓度为70%的乙醇溶液中，冰上固定2 h，4℃冰箱保存备用。上机前离心除去固定液，PBS 漂洗，滴加新鲜配制的PI 染液，调至细胞浓度为1 ×104个/mL，4 ℃避光孵育30 min，流式细胞仪检测细胞周期。

3 实验结果

3.1 合欢皮总皂苷对人微血管内皮细胞增殖的影响

所制合欢皮总皂苷粉末的干物质提取率为2.95%，总皂苷含量为63.18%。由图1 可见，HMEC-1 细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖关系，其中作用48 h 时，合欢皮总皂苷对HMEC-1 细胞的抑制效果较好，其IC50为1.5 μg/mL。

图1 合欢皮总皂苷对HMEC-1 细胞增殖的影响Fig.1 The intervention effect of A.julibrissin saponins on HMEC-1 cell proliferation

3.2 合欢皮总皂苷对人微血管内皮细胞形态的影响

通过光学显微镜可以发现，阴性组中细胞生长良好，细胞形态规则，加入合欢皮总皂苷干预后，随着剂量的增加，细胞数量明显减少，与阴性组形成显著的差异，结果如图2 所示。

图2 合欢皮总皂苷对HMEC-1 细胞形态的影响(100 ×)Fig.2 The intervention effect of A.julibrissin saponins on HMEC-1 cell morphology (100 ×)

3.3 合欢皮总皂苷对人微血管内皮细胞膜通透性的影响

图3 合欢皮总皂苷对HMEC-1 细胞膜完整性的影响(台盼蓝染色，200 ×)Fig.3 The intervention effect of A.julibrissin saponins on HMEC-1 cell membrane integrity (Trypan blue staining，200 ×)

台盼蓝染色表明，随着合欢皮总皂苷剂量的增加，特别是高剂量组(2.0 μg/mL)有些细胞开始出现被染成蓝色的现象，正常细胞和凋亡早期细胞排斥台盼蓝染料，凋亡晚期和坏死细胞由于细胞膜通透性变化，出现摄取染料变蓝的现象，说明合欢皮总皂苷在高剂量下有可能改变细胞膜的通透性，引起细胞的凋亡坏死，结果如图3 所示。

3.4 DNA Ladder 分析观察人微血管内皮细胞凋亡的情况

电泳凝胶成像如图4 显示，合欢皮总皂苷作用48 h 后三个剂量组均出现凋亡梯形条带现象，而在高剂量组(2.0 μg/mL)甚至出现了弥散现象，初步推断高剂量的合欢皮总皂苷可能使细胞发生了坏死现象。

图4 合欢皮总皂苷对HMEC-1 细胞凋亡的影响Fig.4 The intervention effect of A.julibrissin saponins on HMEC-1 cell apoptosis

3.5 合欢皮总皂苷对人微血管内皮细胞周期的影响

由表1 所示，合欢皮总皂苷各剂量组干预48 h和72 h 后，细胞被阻滞在亚G0/G1期，G0/G1期所占比例减少，且细胞周期变化呈药物剂量和时间的依赖关系。

4 讨论

内皮细胞的激活、增殖、迁移、基质降解及血管重构、血管和血管网形成等，在肿瘤新生血管生成过程中起着极重要的作用，其中最重要的是内皮细胞的增殖。已有文献报道合欢皮粗提取物在动物体内明显抑制肿瘤新生血管生成，从而抑制肿瘤生长、侵袭和迁移［3-9］。

本文证明合欢皮总皂苷可显著抑制人微血管内皮细胞HMEC-1 的体外增殖，且与时间、剂量均存在依赖关系，作用48 h 后的IC50为1.5 μg/mL。高剂量组(2.0 μg/mL)作用时，光学显微镜发现细胞数量减少，台盼蓝染色发现其可能改变细胞膜的通透性，DNA 梯形条带法发现其引起HMEC-1 细胞DNA弥散，提示出现细胞坏死现象。流式细胞仪PI 单染结果显示，合欢皮总皂苷可使HMEC-1 细胞周期阻滞在亚G0/G1期。

表1 合欢皮总皂苷作用后HMEC-1 细胞周期分布Table 1 HMEC-1 cell cycle under A.julibrissin saponins intervention

综上所述，合欢皮总皂苷提取物具有抑制血管内皮细胞增殖的作用，使细胞周期阻滞在亚G0/G1期，在高剂量作用下可能引起细胞产生坏死。

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