味噌异黄酮类化学成分

陈权威，田 瑛，高 婷，陈恒文，董俊兴*

1中南大学药学院，长沙 410013;2军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850

味噌是一种传统的大豆发酵产品，其发酵过程与日本的miso，韩国的chungkookjang，doenjang，kochujang 等相似，在亚洲国家，作为调味品一直被广泛使用。现代研究发现，大豆的发酵产品不仅天然、营养、安全，而且药理作用丰富，如抗氧化、抗癌变、抗高血压、降血糖、抗糖尿病等［1-5］，具有潜在的药用价值。为阐明大豆发酵产品的药用物质基础，对味噌正丁醇萃取部位的化学成分进行了深入系统的研究。本文主要介绍分离得到的6 个异黄酮类化合物:染料木素(1)、大豆素(2)、黄豆黄素(3)、4'，5，7，8-四羟基异黄酮(4)、4'，7，8-三羟基异黄酮(5)、4'，7，8-三羟基-6-甲氧基异黄酮(6)，化合物1～6均为首次从味噌中分离得到。

1 仪器与材料

供试样品购买于大连松井味噌有限公司。标本存放于本实验室。

Varian UNITY INOVA 600 超导核磁共振谱仪(美国Varian 公司)，TMS 为内标;Finnigan LCQ Advantage Max 液相色谱-质谱联用仪(美国Finnigan 公司);BP211D 电子天平(美国Sartorius 公司);Sephadex LH-20 凝胶(瑞士Pharmacia 公司);薄层色谱硅胶GF254和柱色谱硅胶200～300 目(青岛海洋化工厂);所用试剂为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

2 方法与结果

将购买的味噌原料100 Kg 用95 %乙醇回流提取3 次，合并提取液，减压回收溶剂得浸膏7.8 Kg。取浸膏1500 g 用蒸馏水溶解后依次用石油醚和正丁醇进行萃取，分别得到石油醚部位251 g、正丁醇部位250 g 和水部位960 g。取正丁醇部位244 g，经硅胶柱色谱(氯仿-甲醇梯度洗脱，20∶1，10∶1，5∶1，5∶2，1∶1)分离，并用薄层色谱进行检测，合并相似组分得到fractions A～E 五个流分。Fr.B 经硅胶柱色谱(氯仿-甲醇梯度洗脱，20∶1，10∶1，5∶1)分离以及重结晶，得到化合物1(1200 mg)。Fr.C 经硅胶柱色谱(氯仿-甲醇梯度洗脱，20∶1，10∶1，5∶1)和凝胶柱色谱(氯仿-甲醇1 ∶1 洗脱)分离，得到化合物2(1000 mg)和化合物3(20 mg)。Fr.D 经硅胶柱色谱(氯仿-甲醇梯度洗脱，15∶1，12∶1，10∶1，8∶1，4∶1)、凝胶柱色谱(氯仿-甲醇1∶1 洗脱)、PHPLC(甲醇-水35∶65)分离得到化合物4(21 mg)、5(36 mg)和6(4 mg)。

3 结构鉴定

化合物1 黄色粉末，易溶于甲醇，FeCl3显色反应呈阳性。分子式C15H10O5，ESI-MS m/z:271［M+H］+，269［M-H］-;1H NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:6.22 (1H，s，H-6)，6.38 (1H，s，H-8)，6.81 (2H，d，J=8.7 Hz，H-3'，5')，7.37 (2H，d，J=8.7 Hz，H-2'，6')，8.33 (1H，s，H-2)，9.63 (1H，s，OH-4')，10.83 (1H，s，OH-7)，12.96 (1H，s，OH-5);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)δ:93.6 (C-8)，98.9 (C-6)，104.4 (C-10)，115.0 (C-3'，5')，121.2 (C-3)，122.2 (C-1')，130.1 (C-2'，6')，153.9 (C-2)，157.4 (C-5)，157.5 (C-9)，162.0 (C-4')，164.2(C-7)，180.2 (C-4)。通过波谱数据分析并与文献［6］比较，鉴定化合物1 为染料木素(genistein)，即4'，5，7-三 羟基异黄酮(4'，5，7-trihydroxy isoflavone)。

化合物2 黄色粉末，易溶于甲醇，FeCl3显色反应呈阴性。分子式C15H10O4，ESI-MS m/z:255［M+H］+，253［M-H］-;1H NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:6.81 (2H，d，J=8.4 Hz，H-3'，5')，6.87 (1H，d，J=2.2 Hz，H-8)，6.84 (1H，dd，J=2.2，9.0 Hz，H-6)，7.38 (2H，d，J=8.4 Hz，H-2'，6')，7.97(1H，d，J=9.0 Hz，H-5)，8.30 (1H，s，H-2)，9.55(1H，s，OH-4')，10.81 (1H，s，OH-7);13C NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ:102.1 (C-8)，115.0 (C-3'，5')，115.2 (C-6)，116.7 (C-10)，122.6 (C-3)，123.5 (C-1')，127.3 (C-5)，130.1 (C-2'，6')，152.4 (C-4')，152.9 (C-2)，157.5 (C-9)，163.1(C-7)，174.8 (C-4)。通过波谱数据分析并与文献［6］比较，鉴定化合物2 为大豆素(daidzein)，即4'，7-二羟基异黄酮(4'，7-dihydroxy isoflavone)。

化合物3 白色粉末，易溶于甲醇，FeCl3显色反应呈阴性。分子式C16H12O5，ESI-MS m/z:285［M+H］+，283［M-H］-;1H NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:3.87 (3H，s，OCH3)，6.80 (2H，d，J=8.7 Hz，H-3'，5')，6.93 (1H，s，H-8)，7.38 (2H，d，J=8.7 Hz，H-2'，6')，7.42 (1H，s，H-5)，8.27 (1H，s，H-2)，9.49 (1H，s，OH-4')，10.54 (1H，s，OH-7);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)δ:55.8 (OCH3)，102.8(C-8)，104.7 (C-5)，114.9 (C-3'，5')，116.2 (C-10)，122.7 (C-1')，122.9 (C-3)，130.0 (C-2'，6')，146.9 (C-6)，151.7 (C-9)，152.4 (C-2)，152.8 (C-7)，157.1 (C-4')，174.3 (C-4)。通过波谱数据分析并与文献［7］比较，鉴定化合物3 为黄豆黄素(glycitein)，即4'，7-二羟基-6-甲氧基异黄酮(4'，7-dihydroxy-6-methoxy isoflavone)。

化合物4 黄色粉末，易溶于甲醇，FeCl3显色反应呈阳性。分子式C15H10O6，ESI-MS m/z:287［M+H］+，285［M-H］-;1H NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:6.28 (1H，s，H-6)，6.81 (2H，d，J=9.0 Hz，H-3'，5')，7.37 (2H，d，J=9.0 Hz，H-2'，6')，8.35(1H，s，H-2)，8.72 (1H，s，OH-7)，9.55 (1H，s，OH-4')，10.52 (1H，s，OH-8)，12.36 (1H，s，OH-5);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)δ:98.7 (C-6)，104.1(C-10)，115.0 (C-3'，5')，121.4 (C-3)，121.8 (C-1')，124.9 (C-8)，130.2 (C-2'，6')，145.9 (C-9)，153.2 (C-7)，153.5 (C-5)，153.8 (C-2)，157.3 (C-4')，180.1 (C-4)。通过波谱数据分析并与文献［8］比较，鉴定化合物4 为4'，5，7，8-四羟基异黄酮(4'，5，7，8-tetrahydroxy isoflavone)。

化合物5 黄色粉末，易溶于甲醇，FeCl3显色反应呈阳性。分子式C15H10O5，ESI-MS m/z:271［M+H］+，269［M-H］-;1H NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:6.79 (2H，d，J=9.0 Hz，H-3'，5')，6.94 (1H，d，J=8.4 Hz，H-6)，7.37 (2H，d，J=9.0 Hz，H-2'，6')，7.46 (1H，d，J=8.4 Hz，H-5)，8.32 (1H，s，H-2)，9.40 (1H，s，OH-7)，9.49 (1H，s，OH-4')，10.27 (1H，s，OH-8);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)δ:114.1 (C-6)，114.9 (C-3'，5')，115.6 (C-5)，117.4 (C-10)，122.6 (C-3)，122.9 (C-1')，130.0 (C-2'，6')，132.8 (C-8)，146.7 (C-9)，149.9(C-7)，152.6 (C-2)，157.1 (C-4')，175.1 (C-4)。通过波谱数据分析并与文献［8］比较，鉴定化合物5为4'，7，8-三羟基异黄酮(4'，7，8-trihydroxy isoflavone)。

化合物6 黄色粉末，易溶于甲醇，FeCl3显色反应呈阳性。ESI-MS m/z:301［M +H］+，299［MH］-，结合1H NMR、13C NMR 谱确定其分子式为C16H12O6，不饱和度为11。由化合物6 的1H NMR 和13C NMR(表1)显示，δH8.28(1H，s)为异黄酮2 位的特征氢信号，碳谱上δC152.3 为2 位碳的信号。δH6.80(2H，d，J=9.0 Hz)和7.38(2H，d，J=9.0 Hz)的两对芳香质子成AA'BB'耦合系统，为异黄酮分子母核B 环上两对碳δC114.9(C-3'，5')和130.1(C-2'，6')的四个氢，同时可判断B 环为对位取代。δH3.87(3H，s)为甲氧基的特征氢信号。δH7.04(1H，s)为母核A 环上的芳香质子，δH9.50(3H，br s)为三个羟基质子，δC174.6 为羰基碳(C-4)的特征碳信号。通过HMBC 远程相关谱发现，羰基碳(δC174.6，C-4)与芳香质子(δH7.04，1H，s)相关，说明此芳香质子是5 位碳上的质子，同时还发现此质子与δC140.0、142.5 和146.8 的三个碳呈远程相关，结合文献，确定这三个碳分别为7 位、9 位和6 位碳。进一步观察，可见6 位碳和甲氧基呈远程相关，故确定6 位碳被甲氧基取代。剩下的三个羟基分别取代4'位、7 位和8 位。综上所述，数据归属为:1H NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:3.87 (3H，s，OCH3)，6.80 (2H，d，J=9.0 Hz，H-3'，5')，7.04 (1H，s，H-5)，7.38 (2H，d，J=9.0 Hz，H-2'，6')，8.28 (1H，s，H-2)，9.50 (3H，br s，OH-4'，7，8);13C NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ:55.8 (OCH3)，95.1 (C-5)，114.9 (C-3'，5')，115.9 (C-10)，122.6 (C-3)，122.9 (C-1')，130.1 (C-2'，6')，133.7 (C-8)，140.0 (C-7)，142.5 (C-9)，146.8 (C-6)，152.3 (C-2)，157.0 (C-4')，174.6 (C-4)。与文献［9］比较，鉴定化合物为4'，7，8-三羟基-6-甲氧基异黄酮(4'，7，8-trihydroxy-6-methoxy isoflavone)。

图1 化合物1～6 的化学结构Fig.1 The molecular structures of compounds 1-6

4 讨论

大豆发酵产品丰富的生理调节作用与其物质基础密切相关，其中异黄酮类化合物是重要的药理活性成分之一。研究发现，未发酵大豆中异黄酮类化合物主要以糖苷形式存在(如染料木苷、大豆苷及黄豆黄苷)，经发酵后，其异黄酮糖苷易被水解成相应的异黄酮苷元(即染料木素、大豆素及黄豆黄素)［10，11］，并且在微生物二次代谢作用下可能生成新的异黄酮苷元。

研究发现，发酵生成的异黄酮苷元脂溶性增强，更容易被机体吸收和利用，且更易透过细胞膜进入到细胞内部产生作用，从而提高药物的生物利用度和活性［11］。体外研究发现，4'，5，7，8-四羟基异黄酮和4'，7，8-三羟基异黄酮的8 位羟基被糖取代后，其抑制络氨酸酶的活性便散失［8］;染料木素对MCF-7和BT20 乳腺肿瘤细胞具有抗肿瘤的作用，而糖苷型的染料木苷未表现抗肿瘤的活性［12］。

本文研究味噌的异黄酮类化学成分发现，化合物1～3 是由大豆原有的三种异黄酮糖苷水解而来;化合物4～6 的母核结构在未发酵大豆中不存在相应的糖苷，因此化合物4～6 可能是微生物二次代谢生成的新物质。

1 Luft FC，Rankin LI，Bloch R.，et al.Cardiovascular and humoral responses to extremes of sodium intake in normal black and white men.Circulation，1979，60:697-706.

2 Miller JZ，Weinberger MH，Daugherty SA，et al.Heterogeneity of blood pressure responses to dietary sodium restriction in normotensive adults.J Chronic Dis，1987，40:245-250.

3 Moktan B，Saha J，Sarhar PK，et al.Antioxidant activities of soybean as affected by Bacillus-fermentation to kinema.Food Res Int，2008，41:586-593.

4 Kim DJ，Jeong YJ，Kwon JH，et al.Beneficial effect of chungkukjang on regulating blood glucose and pancreatic β-cell functions in C75BL/KsJ-db/db mice.J Med Food，2008，11:215-223.

5 Watanabe H，Kashimoto N，Kajimura J，et al.A miso(Japanese soybean paste)diet conferred greater protection against hypertension than a sodium chloride diet in dahl salt-sensitive rats.Hypertens Res，2006，29:731-738.

6 Yuan SQ(袁珊琴)，Yu NJ(于能江)，Zhao YM(赵毅民)，et al.Chemical Constituents of Dan Dou Chi(淡豆豉中的化学成分).J Chin Med Mater(中药材)，2008，31:1172-1174.

7 Park HJ，Park JH，Moon JO，et al.Isoflavone glycosides from the flowers of Pueraria thunbergiana.Phyto，1999，51:147-151.

8 Chang TS.Two potent suicide substrates of mushroom tyrosinase:7，8，4'-trihydroxyisoflavone and 5，7，8，4'-tetrahydroxyisoflavone.J Agric Food Chem，2007，55:2010-2015.

9 Hayashi T，Thomson R.Isoflavones from Dipteryx Odorata.Phyto，1974，13:1943-1946.

10 Naim M，Gestetneer B，Zilkah S，et al.Soybean isoflavones characterization，determination，and antifungal activity.J Ag-ric Food Chem，1974，22:806-810.

11 Ji GE.Stucture-function analysis of transfromed phytochemical glycosides.FASEB J，2009，23:111.

12 Theil C，Brises V，Gerber B，et al.The efects of different lignans and isofavones，tested as aglycones and glycosides，on hormone receptor-positive and negative breast carcinoma cells in vitro.Arch Gynecol Obstet，2011，284:459-465.