香辛植物精油对常见呼吸道致病菌气相抗菌作用的研究

吴克刚，林雅慧，柴向华，赵欣欣

1广东工业大学轻工化工学院食品科学与工程系，广州 510006;2 广州甘蔗糖业研究所，广州 510316

空气中存在着许多细菌和病毒等微生物，尤其是人口密集区，其成为传播疾病的媒介。空气中的微生物主要来源于土壤、水体表面、动植物、人体及生产活动、污水污物处理等，以气溶胶形式存在，是引发各种呼吸道传染病的根源［1］。微生物气溶胶主要引起一些呼吸道疾病，如黏膜刺激、支气管炎、过敏性鼻炎、哮喘、外源过敏性肺泡炎及一些吸入性感染等。由于人们绝大部分的时间都是在室内度过，因而防止、控制室内空气微生物污染尤为重要，有效的空气净化消毒是控制室内空气微生物污染、预防疾病发生、保障身体安全的重要措施之一。目前室内空气消毒主要包括紫外线灯、空气层流室、负离子发生器等物理方法以及臭氧、熏蒸剂、过氧化氢、含氯表面消毒剂、中草药制剂等化学方法［2］。植物释放的挥发性有机物质，能把飘浮在大气中的病原微生物杀死，从而起到了空气消毒、净化作用，如研究表明许多芳香植物精油具有较强的抗菌活性，可挥发扩散到空气形成气相，发挥空气消毒作用［3，4］。本文主要研究比较香辛植物精油对几种常见呼吸道致病菌的气相抗菌活性，为其应用于空气消毒提供重要的参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试菌种:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 26001、溶血性链球菌(Streptococcus pneumoniae)ATCC 19615、大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 25922、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella peneumoniae)ATCC 10031、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 9027 由广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心提供;肺炎链球菌(Streptococcus pyogenes)ATCC 12344 由广东省微生物研究所提供。

香辛植物精油:山苍籽油、丁香油、肉桂油、八角茴香油、迷迭香油由广东工业大学食品添加剂与食品安全研究室提供;薄荷油、桉叶油、茶树油、芳樟油、甜橙油、香柠檬油、甘牛至油、香紫苏油由广州百花香料股份有限公司提供。

培养基:营养琼脂、脑心浸膏(BHI)琼脂、缓冲蛋白胨(BP)购于广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化及菌悬液的配制

取菌种于营养肉汤(或BHI 肉汤)活化24 h，平板分离单个菌落，挑取单个菌落制得0.5 麦氏单位(1.5 ×108CFU/mL)的菌悬液。

1.2.2 气相熏蒸法测MIC 和MBC

参考Lopez 的气相挥发试验［4］。含定量凝固培养基的平皿上加入100 μL 105～106CUF/mL 的菌悬液，用已灭菌的三角玻棒涂抹均匀。待菌液被吸收后倒置放置。取上述稀释的精油，均匀滴在无菌滤纸片上，置于皿盖内侧中心形成精油气相氛围，取等量的丙二醇作为对照，另设一空白组，每组做3 个平行。抑菌实验直接将此培养皿盖好用封口膜密封;37 ℃培养24 h，观察记录菌体在培养皿的生长情况。杀菌实验取抑菌实验中无菌生长的平板，在无菌环境更换培养皿盖，用封口膜密封，于37 ℃培养24 h 后观察实验结果。如果将气相氛围移除，细菌开始生长，则该浓度为最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC);而仍然没有细菌生长则说明细菌被杀灭，该浓度就是最小杀菌浓度(Minimal Bactericidal Concentration，MBC)。

2 结果与讨论

2.1 植物精油对3 种革兰氏阳性呼吸道致病菌的气相抗菌作用

溶血性链球菌(Streptococcus pyogens)广泛存在于自然界和人及动物粪便和健康人的鼻咽部，是急性呼吸道感染尤其是上呼吸道感染的重要病原菌，也是临床上最重要的链球菌，常引起咽喉炎、扁桃体炎、鼻窦炎、中耳炎、扁桃体周围脓肿等呼吸道感染及一些严重变态反应性并发症［5］。肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是急性呼吸道感染主要的条件致病菌，能引起的疾病有肺炎、支气管炎、支气管肺炎、中耳炎、脑膜炎和败血症等［6］，目前肺炎链球菌对青霉素、红霉素、大环内酯、四环素、复方磺胺、氯霉素等的多重耐药性，其临床上的耐药情况非常严重。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)在自然界中无处不在，是一个非常重要的社区获得性和医院获得性病原菌，能够引起多种人体或动物局部和全身感染，而且其非常善于避开宿主的免疫系统，对多种抗生素产生抗性［7］。为此，实验以溶血性链球菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌3种革兰氏阳性呼吸道致病菌为研究对象，研究香辛植物精油对其气相抗菌作用，结果如表1 所示。

表1 香辛植物精油对3 种革兰氏阳性呼吸道致病菌的MIC 和MBC(μL/L)Table 1 MIC and MBC values of essential oils against Gram-positive respiratory pathogens (μL/L)

实验结果可见，金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎链球菌对13 种植物精油均较为敏感，总体抗菌活性大小依次为:芳樟油、薄荷油(亚洲)、山苍籽油＞香紫苏油＞香柠檬油＞迷迭香油、桉叶油＞茶树油、甘牛至油＞八角茴香油＞甜橙油＞肉桂油＞丁香油。除了肉桂油、丁香油、甜橙油、八角茴香油外，其他植物精油对3 种革兰氏阳性呼吸道致病菌的MIC 和MBC 均未超过1000 μL/L，其中香紫苏油、香柠檬油、迷迭香油、桉叶油不超过500 μL/L，特别是芳樟油、薄荷油(亚洲)、山苍籽油在250 μL/L 就可对3 种革兰氏阳性均产生抑菌、杀菌作用。13 种供试植物精油中，甜橙油对溶血性链球菌抗菌效果最好，但对金黄色葡萄球菌抗菌效果最差;丁香油对金黄色葡萄球菌抗菌效果最好，但对溶血性链球菌、肺炎链球菌抗菌效果最差。3 种革兰氏阳性呼吸道致病菌中溶血性链球菌对植物精油最为敏感，除丁香油、八角茴香油外，其它植物精油的MIC和MBC 均未超过500 μL/L，这与溶血性链球菌的抵抗力有关，它对常用消毒剂敏感，60 ℃30 min 即被杀死，对青霉素、红霉素、氯霉素、四环素、磺胺均敏感，很少有耐药性。

2.2 香辛植物精油对3 种革兰氏阴性呼吸道致病菌的气相抗菌作用

大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)是人和动物肠道中的一种共栖菌，多数致病性大肠杆菌都能够通过消化道、接触感染以及通过形成气溶胶造成呼吸道感染，常被用作环境、水、食品卫生污染的指示菌。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae，K.pneumoniae)广泛分布于自然界，是人和动物肠道、呼吸道、泌尿生殖道的致病菌，可在全身各部位发生感染，但最高的发病率在尿路和呼吸道［8］。近年来该菌成为仅次于大肠杆菌的最重要的致病菌。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa)又名绿脓杆菌，是假单胞菌中最常见的院内感染条件致病菌，正常情况下并不感染人体任何组织，一般是在宿主的正常防御机制发生改变或损伤(如长期使用激素、进行肿瘤化疗、放疗等导致免疫功能低下或者烧伤时致病)，因此它属于条件致病菌［9］，极易在医院内人群中引起严重的感染，是医院获得性肺炎、医院获得性泌尿道感染、外科创伤感染，烧伤性感染和血液感染的主要病原体。为此，实验以大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌3 种革兰氏阴性呼吸道致病菌为研究对象，研究香辛植物精油对其气相抗菌作用，结果如表2 所示。

实验结果可见，与革兰氏阳性呼吸道致病菌比较，大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌3 种革兰氏阴性呼吸道致病菌明显对13 种植物精油不太敏感，需要较高的浓度才能抑制、杀灭3 种菌。总体抗菌活性大小依次为:迷迭香油＞茶树油＞山苍籽油＞肉桂油＞桉叶油＞芳樟油＞甘牛至油＞八角茴香油＞丁香油＞甜橙油＞薄荷油(亚洲)＞香紫苏油＞香柠檬油。迷迭香油浓度达到1000 μL/L 时可对3 种革兰氏阴性均产生抑菌、杀菌作用。13 种供试植物精油中，茶树油和芳樟油对大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌抗菌效果最好，但对铜绿假单胞菌抗菌效果稍差;迷迭香油对铜绿假单胞菌抗菌效果最好。3 种革兰氏阴性呼吸道致病菌中大肠杆菌对植物精油最为敏感，铜绿假单胞菌最不敏感。其他学者在研究植物精油的抗菌作用时也一致发现铜绿假单胞菌是最不敏感的细菌［4］。有研究表明铜绿假单胞菌对多种不同抗生素高度耐药，这归因于其外膜通透性很低、产生抗生素修饰酶、降低抗生素作用位点敏感性、降低抗生素通透性的作用机制［10］。

表2 香辛植物精油对3 种革兰氏阴性呼吸道致病菌的MIC 和MBC(μL/L)Table 2 MIC and MBC values of essential oils against Gram-negative respiratory pathogens (μL/L)

3 结论

利用植物精油的挥发气相抗菌活性控制空气致病性微生物是一种绿色、安全的空气净化消毒方法。金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎链球菌3 种革兰氏阳性呼吸道致病菌对13 种香辛植物精油均较为敏感，特别是芳樟油、薄荷油(亚洲)、山苍籽油抗菌活性很高，MIC 和MBC 均为250 μL/L;大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌3 种革兰氏阴性呼吸道致病菌明显对13 种香辛植物精油不太敏感，需要较高的浓度才能抑制、杀灭，其中迷迭香油抗菌活性较高，MIC 和MBC 为1000 μL/L;6 种呼吸道致病菌中铜绿假单胞菌对13 种香辛植物精油最不敏感，这与其对多种抗生素高度耐药机制类似。

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