Bcl-2与Ki-67蛋白在喉鳞癌中的表达检测及临床相关性分析

谢金龙，罗招阳，袁恩健，陈永春，左建宏(.解放军第一六九中心医院 肿瘤科，湖南 衡阳 400；.南华大学医学院肿瘤研究所)

喉鳞癌是头颈部最常见的鳞状细胞癌[1]，是仅次于肺癌的第二大呼吸道恶性肿瘤，是全球第六位最常见的恶性肿瘤，每年新发病例数超过50万，近30年来死亡率仍较高[2]，严重威胁着人类的健康和生命，因此对喉鳞癌进行深入研究具有十分重要的意义。

恶性肿瘤发生的过程是基因的多阶段的损伤积累的结果，Bcl-2是原癌基因，其肿瘤组织中常表达异常[3]。Bcl-2高表达可抑制肿瘤细胞的凋亡，有利于变异基因的积累，增加了肿瘤细胞的侵袭转移的机会。无限增殖是癌细胞的重要特征之一，而Ki-67是细胞增殖的重要指标[4]，能反映恶性肿瘤增殖率，其高表达是细胞增殖活跃的重要标记。而抗凋亡家族的Bcl-2蛋白和核增殖Ki-67蛋白在喉鳞癌中的表达及二者表达相关性的研究鲜见报道。因此，本研究的目的主要是检测喉鳞癌组织和正常喉粘膜组织的中Bcl-2和Ki-67蛋白的表达，分析其与喉鳞癌的临床病理特征之间的关系，并探讨两者之间的相关性，为喉鳞癌患者的早期诊断、转移监测和预后评价提供实验依据，同时也为喉鳞癌的靶向治疗奠定基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年1月～2013年12月术前未经放疗、化疗的喉鳞状细胞癌手术切除存档的病理标本54例，男44例，女10例，年龄37～76岁，平均年龄62.4岁，大于60岁有29例，小于60岁有25例。所有标本均经病理诊断和免疫组化证实为喉鳞状细胞癌。手术病理证实18例患者伴有淋巴结转移，36例患者无淋巴结转移。恶性肿瘤按照2008年WHO喉鳞癌分类标准进行组织学分级：高分化(G1)16例、中分化(G2)19例、低分化(G3)19例，按照2002年国际抗癌协会(UICC)制定的TNM分期标准(第7版《病理学》教材，人民卫生出版社)，Ⅰ～Ⅱ期为37例，Ⅲ～Ⅳ期为17例。正常的喉粘膜组织(法医尸检)或喉癌旁正常组织42例，作为对照。

1.2 试剂

鼠抗人Bcl-2、Ki-67蛋白单克隆抗体，免疫组化即用型SP试剂盒，液体DAB酶底物显色试剂盒，上述试剂均购自福建迈新生物科技有限公司。

1.3 主要仪器

高压锅，LEICA RM125轮式切片机，Olympus BX41显微镜，丹吉尔图像采集系统。

1.4 实验方法

SP免疫组织化学染色按试剂盒说明书进行。

1.5 统计学分析

结果判定参照Pavlovic B[5]等的标准。应用计算机spss13.0统计软件包进行相关数据统计分析。计数资料用率表示，等级资料采用非参数的秩和检验，组间比较用χ2检验，Bcl-2和Ki-67在喉鳞癌组织中的表达的相关性比较采用Spearrnan相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Bcl-2和Ki-67蛋白在正常的喉粘膜组织和喉鳞癌组织中的表达检测

Bcl-2和Ki-67蛋白在喉鳞状细胞癌中的表达情况(见图1)：Bcl-2蛋白着色主要定位于细胞的胞质和胞膜中，在喉鳞状细胞癌中阳性率为70.37%；而在正常喉粘膜组织中不表达或在基底层微弱表达，阳性率仅为9.52%(表1)，Bcl-2蛋白在喉鳞癌中的表达水平明显高于在正常喉粘膜鳞状上皮组织中的表达水平(P<0.05)。而Ki-67蛋白的着色位于细胞核内，呈棕色颗粒，在喉鳞癌组织中阳性率为81.48%，在正常喉粘膜组织阳性表达率为16.7%，亦在喉鳞癌组织中阳性率显著高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

表1 喉鳞癌组织中及正常喉粘膜鳞状上皮组织中Bcl-2和Ki-67蛋白的表达分析

2.2 Bcl-2和Ki-67蛋白的表达与其临床病理关系分析

Bcl-2蛋白的表达水平与临床分期、淋巴结转移有明显相关性(P<0.05)，但与性别、年龄等无关。Ki-67蛋白在喉鳞癌组织TNM分期中阳性表达晚期高于早期、且与分化程度明显相关，在分化程度较低的喉鳞癌癌组织中表达较高；与淋巴结转移有关(P<0.05)，与年龄和性别无关(P>0.05，见表2)。

图1 IHC分析Bcl-2、Ki-67在正常组织和喉癌组织中的表达(×400)

表2 喉鳞癌组织Bcl-2和Ki-67蛋白表达与临床资料的相关性分析

2.3 Bcl-2蛋白和Ki-67蛋白表达相关性

44例Ki-67蛋白阳性表达的喉鳞癌组织标本中有34例同时表达Bcl-2蛋白。相关性分析结果显示，Bcl-2蛋白与Ki-67表达呈中度正相关(rs=0.317，P<0.05)。

表3 Bcl-2蛋白和Ki-67蛋白在LSCC中表达的相关性分析

3 讨 论

喉鳞癌是头颈部最常见的上皮组织来源的恶性肿瘤之一，该病具有起病隐匿、侵袭力强、易复发和转移以及预后差的特点[6]，因此，深入研究其分子机制具有十分重要意义。

正常细胞的增殖、分化和凋亡处于一种动态平衡状态，而增殖和凋亡的失衡[7]是导致恶性肿瘤发生的重要机制之一。Bcl-2是属于一类重要的抗凋亡基因，其表达失调将引起细胞紊乱、参与肿瘤的发生[8]，同时，本课题组前期研究发现Bcl-2高表达还能促进肿瘤细胞的侵袭与转移[9]。在本实验中，喉鳞癌中的Bcl-2呈现高表达，表达阳性率明显高于正常组织，且与喉鳞癌的淋巴结转移密切相关(P<0.01)，提示Bcl-2蛋白可能参与了喉鳞癌发生与发展，这为临床诊断喉鳞癌提供了参考价值[10]。Ming Geng等研究发现Bcl-2表达水平高的胃癌患者容易出现广泛淋巴结转移，其预后较差[11]，与本研究结果一致。本研究结果显示：Bcl-2蛋白在喉鳞癌Ⅲ～Ⅳ期中的表达显著高于喉鳞癌Ⅰ～Ⅱ期中的表达(P<0.05)，肿瘤临床分期愈晚，组织分化恶性程度愈高，Bcl-2蛋白阳性表达也愈高。在甲状腺癌[12]、肺癌[13]、胆囊癌[14]、前列腺癌[15]和头颈部鳞癌[9]中Bcl-2蛋白的高表达与恶性肿瘤的侵袭转移和预后不良密切相关，上述报道与本课题研究也保持一致。同时，Bcl-2高表达的恶性肿瘤细胞也可能因为逃避凋亡而过度积累，对凋亡信号变得不敏感，则使肿瘤细胞获得生存优势，从而有利于喉鳞癌的发生及发展[9]。总之，Bcl-2高表达在喉鳞癌的恶性进展、局部浸润转移及颈淋巴结转移中起重要的作用，是其预后不良的一个标志。

Ki-67蛋白是一种与细胞增殖密切相关的核抗原，是可靠并迅速地反映恶性肿瘤增殖率的指标，其高表达是细胞增殖活跃的重要标记物[16]，对肿瘤的转移及预后有影响[17]。本课题组研究发现：Ki-67蛋白在喉鳞癌中的阳性率为81.48%，而在正常喉粘膜中的表达仅为16.67%，两者比较有显著的意义(P<0.05)。Ki-67的表达还与分期和颈淋巴结转移有关，有颈淋巴结转移的喉鳞状细胞癌组织中Ki-67蛋白的表达高于未发生转移者(P< 0.05)，提示喉鳞癌细胞增殖活跃与侵袭性强，易发生转移，预后不良等密切相关。本研究结果与Rademakers SE等[18]所报道的Ki-67蛋白在喉鳞癌中的高表达增加了侵袭转移风险的结论相一致。

本研究结果显示：喉鳞癌中Bcl-2和Ki-67蛋白阳性表达率与组织学分级、TNM分期及淋巴结转移密切相关，但与年龄、性别等无显著相关性(P>0.05)。与正常组织比较，在喉鳞癌中Bcl-2蛋白与Ki-67蛋白表达明显上调，且两者呈显著相关(rs=0.317,P<0.05)。这与Rahman F等用DigiproTM4.0版图像分析软件在口腔鳞状上皮研究中Bcl-2高表达，Ki-67蛋白指数较高，两者对比有显著的统计学意义[19]的报道相符合。也有学者[20]认为，可以把喉鳞癌中Bcl-2和Ki-67蛋白的表达作为喉鳞癌放射治疗预后判定的指标之一，随表达的增强喉鳞癌对放疗敏感性相应降低，对于两者表达阴性的患者放疗效果显著。但是，有关研究Bcl-2与Ki-67在喉鳞癌发展中协同作用的分子机制尚未完全阐明，有待深入的研究。

[1]Liu Y,Su Z,Li G,et al.Increased expression of metadherin protein predicts worse disease-free and overall survival in laryngeal squamous cell carcinoma[J].International Journal of Cancer,2013,133(3):671-679.

[2]Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2012,62 (1):1029.

[3]Condon LT,Ashman JN,Ell SR,et al.Overexpression of Bcl-2 in squamous cell carcinoma of the larynx:A marker of radioresistance[J].International Journal of Cancer,2002,100(4):472-475.

[4]Koutourousiou M,Georgakoulias N,Kontogeorgos G,et al.Subepen-dymomas of the lateral ventricle:tumor recurrence correlated with increased Ki-67 labeling index[J].Neurol India,2009,57(2):191-193.

[5]Pavlovic B,Djukic V,Milovanovic J,et al.Morphometric analysis of Ki-67 and p16 expression in laryngeal precursor lesions[J].Eur Arch Otorhinolaryngol,2013,270(4):1405-1410.

[6]Marioni G,Marchese-Ragona R,Cartei G,et al.Current opinion in diagnosis and treatment of laryngeal carcinoma[J].Cancer Treat Rev,2006,32:504-515.

[7]詹启敏.分子肿瘤学[M].北京:人民卫生出版社,2005:4-105,16-500.

[8]Czabotar PE,Lessene G,Strasser A,et al.Control of apoptosis by the BCL-2 protein family:implications for physiology and therapy[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2013,15(1):49-63.

[9]Zuo JH,Tohru Ishikawa,Shadi Boutros,et al.Bcl-2 Overexpression Induces a partial epithelial to mesenchymal transition and promotes squamous carcinoma cell invasion and metastasis[J].Mol Cancer Res,2010,8(2):170-182.

[10]Marioni G,Staffieri A,Lionello M,et al.Relationship between anti-apoptotic proteins survivin and Bcl-2,and response to treatment in patients undergoing post-operative RT for laryngeal cancer:a pilot study[J].J Oral Pathol Med,2013,42(4):339-344.

[11]Wang L,Li PF,Geng M,et al.Correlation between chemosensitivity to anticancer drugs and Bcl-2 expression in gastric cancer[J].Int J Clin Exp Pathol,2013,6(11):2554-2559.

[12]郑向文,李文省,刘景峰.肝细胞肝癌组织中Bcl-2核表达和SPARC表达临床意义的探讨[J].中国现代医学杂志,2013,24:58-61.

[13]蒋朋朋,刘继先,吴昊，等.Bcl-2在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义[J].安徽医科大学学报,2013,(3):298-301.

[14]朝乐孟,李全福.胆囊癌组织Bcl-2和p53基因甲基化水平研究[J].承德医学院学报,2013,(1):10-12.

[15]温爽,盖宇,宗华凤,等.前列腺癌组织P504S、E-Cadherin和Bcl-2蛋白表达及意义[J].大连医科大学学报,2013,(2):123-126.

[16]Yang SX,He witt SM,Steinberg SM,et al.Expression levels of e-IF4E,VEGF and cyclin D1,and correlation of eIF4E with VEGF and cyclin D1 in multitum or tissue microarray[J].Oncol Rep,2008,17(2):281-287.

[17]Verhoven B,Yan Y,Ritter M,et al.Ki-67 is an independent predictor of metastasis and cause-specific mortality for prostate cancer patients treated on Radiation Therapy Oncology Group (RTOG) 94-08[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,2013,86(2):317-323.

[18]Rademakers SE.Prognostic value of the proliferation marker Ki-67 in larynx carcinoma:Results of the ARCON phase Ⅲ randomized trial[J].Head Neck,2013,17.

[19]Rahman F,Bhargava A,Tippu SR,et al.Analysis of the immunoexpression of Ki-67 and Bcl-2 in the pericoronal tissues of impacted teeth,dentigerous cysts and gingiva using software image analysis[J].Dent Res J (Isfahan),2013,10(1):31-37.

[20]Ahmed Gamea.Role of Bcl-2 and Ki-67 Expressions in Predicting the Response to Radiotherapy in Cancer Larynx[J].Otolaryngol Head Neck Surg,2013;149(2)suppl P191.