Pokemon对乳腺癌MCF-7细胞侵袭迁移能力的影响

祖旭宇，谭 莉，周 茜，王艺蓁(南华大学附属第一医院临床医学研究所，湖南 衡阳 421001)

在我国北京、上海和广州等大城市的统计显示乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，且发病率呈逐年上升趋势[1]。乳腺癌可通过血运和淋巴等方式发生侵袭转移，侵害肺、骨和肝等器官，是乳腺癌患者治疗失败和死亡的的主要原因。乳腺癌的转移是一个较为复杂、由多基因参与的过程,目前乳腺癌转移机制尚不完全清楚。Pokemon，即POK红髓生成因子(也称为FBI-1或Zbtb7A)，由Zbtb7基因编码，是BTB-ZF家族成员之一，作为转录因子Pokemon参与细胞分化和机体发育等多种重要生命活动，有研究显示Pokemon在肺癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌和鼻咽癌等多种肿瘤中呈现出高表达，表明它可能在多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用[2-5]。崔明等[6]利用免疫组织化学方法发现乳腺癌组织中pokemon蛋白细胞核表达率明显高于癌旁正常乳腺组织及乳腺增生组织，乳腺癌组织有腋窝淋巴结转移组pokemon蛋白细胞核表达率显著高于无腋窝淋巴结转移组，表明pokemon基因在乳腺癌发生、发展中发挥重要作用。本文通过构建稳定表达pokemon慢病毒载体，建立稳定表达pokemon的MCF-7细胞系，观察pokemon对乳腺癌细胞系MCF-7细胞侵袭转移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

MCF-7细胞购自中科院上海生命科学研究院细胞库。细胞由DMEM培养(Hyclone,UT)维持，培养基中均含10%小牛血清( 四季青) 、2 mmol/L glutamine 和100 U青霉素(碧云天)，细胞置于37 ℃，5% CO2，饱和湿度的培养箱培养。

1.2 Pokemon过表达质粒载体构建及慢病毒的包装

Pokemon过表达质粒载体构建及Pokemon过表达慢病毒在293T细胞内的包装和病毒滴度的测定参照祖旭宇等[7]研究进行。

1.3 病毒转染及稳定细胞系建立

取对数期MCF-7细胞按1×105个/孔种于6孔板中，每孔加2 mL培养基，铺板时细胞融合度为50%左右，并培养24 h。感染实验分为两组，即感染含有GFP慢病毒载体和含有FPG-pokemon融合基因慢病毒载体，每组占三个孔。当细胞密度达60%时，每孔中加入1×108TU/mL滴度的病毒50 μL(MOI：50)，置于37 ℃，5%CO2中培养。12 h后更换普通培养基，转染48 h后荧光显微镜下观察荧光。观察到绿色荧光后，利用新霉素筛选稳定表达pokemon慢病毒载体的MCF-7细胞，建立稳定性普通表达及高表达pokemon的MCF-7乳腺癌细胞系。

1.4 Western blot分析

为检测病毒感染MCF-7细胞中Pokemon-GFP融合蛋白的表达情况，对经筛选获得的MCF-7乳腺癌细胞系进行免疫印迹分析。 将GFP慢病毒载体和含有FPG-pokemon融合基因慢病毒载体感染MCF-7细胞于裂解液(10 mol/L HEPES,10 mmol/L KCl,1 mmol/L EDTA,pH 8.0,0.1% NP-40,1 mmol/L DTT,1 mmol/L PMSF和0.5 mmol/L Na3VO4)中置冰上30 min制备细胞抽提物。30 μg可溶性蛋白于12% SDS-PAGE 胶分离,然后蛋白在260 mA下经2 h转移至纤维膜。膜由5%牛奶在室温下封闭45 min后,孵育GFP 一抗(1∶500)(Abcam)1 h,而后孵育羊抗兔IgG(1∶2 000) (Abcam)1 h。抗体结合由化学荧光系统( Pierce,IL)检测。

1.5 Transwell检测

首先用700 μL含有15%FBS的DMEM培养基种于Transwell小室下室中，然后将200 μL含3×105个MCF-7细胞悬液种于Transwell小室上室，37 ℃ 5% CO2培养箱培养24 h后。取出小室用棉签将膜上层细胞拭去，4%多聚甲醛固定5 min，0.5%结晶紫染色，显微镜下计数染色细胞。

1.6 划痕实验

将稳定转染空白病毒组及pokemon表达慢病毒组的MCF-7细胞接种于6孔板中，使用含有10% FBS的DMEM培养48 h至融合度90%以上时，用200 μL移液器吸头于细胞表面画直线，PBS洗两次，加入无血清培养基，分别于0、8、32 h观察细胞迁移状态。

2 结 果

2.1 稳定性表达Pokemon MCF-7细胞系建立

将空病毒载体和pokemon表达病毒载体感染MCF-7细胞后经新霉素筛选获得耐药性细胞克隆。在荧光显微镜下观察稳定性细胞克隆中GFP及融合蛋白的表达情况，发现对照细胞系中绿色荧光主要集中在胞质，而稳定性表达pokemon -GFP融合蛋白表达主要分布于胞核，这与pokemon作为转录因子主要分布于细胞核一致(图1)。为进一步证实在稳定细胞系中pokemon-GFP融合蛋白的表达情况，分别提取两组稳转细胞系总蛋白，Western blot显示空病毒稳转组仅有GFP蛋白表达，而pokemon表达慢病毒转染组中6号克隆具有pokemon-GFP融合蛋白表达，说明稳定表达细胞系构建成功(图2)。

图1 空病毒载体及pokemon表达慢病毒载体(pokemon)感染MCF-7细胞(×40)

图2 MCF-7细胞克隆中GFP和GFP-pokemon融合蛋白表达

2.2 pokemon对MCF-7细胞侵袭能力的影响

将3×105个MCF-7细胞悬液种于Transwell小室上室，37 ℃ 5% CO2培养箱培养24 h后，将膜上细胞擦掉，膜下层的细胞数量反应了细胞的转移能力。经过染色后，表达pokemon-GFP融合蛋白组比对照组(NC组)到达膜下面的细胞数量明显减少(P<0.05，图3)。

图3 pokemon对MCF-7细胞侵袭能力影响

2.5 pokemon对MCF-7细胞迁移能力的影响

通过划痕实验进一步检测pokemon对MCF-7细胞迁移能力的影响，其结果显示，对照组和pokemon-GFP融合蛋白组细胞迁移的距离于8 h、32 h后无明显变化(图4)。

图4 pokemon对MCF-7细胞迁移能力的影响

3 讨 论

乳腺癌转移是一个受多种因素影响，机制复杂的过程，具体机制尚不清楚，也是乳腺癌防治研究的热点。转移相关基因是一类功能上能够促进或阻断肿瘤转移潜能的基因，是肿瘤转移发生的内在分子基础[8]。因此揭示相关基因在乳腺癌侵袭转移中的作用及机制是乳腺癌防治研究的重要课题。Maeda T等[9]揭示Pokemon可能是一种原癌基因，在肿瘤的形成过程中发挥至关重要的作用。Pokemon位于多种重要原癌基因的上游，调控多种原癌基因的转录过程，它的靶基因包括ARF、ADH5/FDH、BIRC5(survivin)、肿瘤抑制因子Rb、原癌基因C-fos 和C-myc等。这些靶基因都主要与细胞周期、细胞分化和生物合成有关，说明pokemon基因在细胞生长、分化、转移和癌变中的重要作用[10-11]。已有研究显示和正常乳腺组织相比，乳腺癌细胞中的pokemon存在过度表达，且乳腺癌中pokemon高表达和腋窝淋巴结转移有关[12-13]。

慢病毒载体是由慢病毒改造而来的载体系统，其具有高效而稳定的转染率，因此成为近年来稳定转染较常用的载体[14-15]。由于该病毒载体具有GFP和Puromycin抗性筛选标记，FIV/Pokemon重组病毒可进一步用于动物和细胞模型的建立。MCF-7细胞系是一种经典的乳腺癌细胞系，其具有分化的乳腺癌上皮细胞一些特性，如雌二醇合成以及表达雌激素和孕激素受体[16]，是一种重要的乳腺癌研究细胞模型。本文分别用空白载体及pokemon慢病毒载体感染MCF-7细胞，通过Western blot方法检测并证实了稳定性MCF-7细胞克隆中pokemon-GFP融合蛋白的表达。

本研究通过成功构建pokemon表达慢病毒载体，建立了稳定表达pokemon-GFP MCF-7细胞系，并且通过实验发现pokemon可抑制MCF-7细胞侵袭能力，但对MCF-7细胞迁移能力无显著影响。Pokemon在细胞水平可抑制MCF-7细胞侵袭能力，这一现象与在乳腺癌组织中观察到pokemon高表达和腋窝淋巴结转移存在正相关不一致。而Maeda T等[9]的研究也发现，虽然pokemon可诱发肿瘤的形成，但临床研究却证实pokemon在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的阳性率与患者的生存期呈正相关。最近Wang GC 等[17]的研究证实pokemon可通过Sox9通路抑制前列腺癌的发生发展，这说明pokemon对肿瘤发生的作用可因不同肿瘤基因背景的差异而发生改变。Pokemon在细胞水平的功能和其与临床预后的相关性存在不一致，这也进一步提示Pokemon在肿瘤发生发展中的作用存在复杂性机制。本文在研究蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMT2)在乳腺癌发生中的作用时也观察到类似现象：PRMT2可抑制乳腺癌细胞增殖，但其在乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织[18]。由于细胞较组织器官环境相对单一，基因在细胞与组织器官中可能会表现出不同功能，而对基因在细胞和组织器官中可能存在功能差异机制的阐明，将有助于人们深入了解基因在肿瘤发生发展中的复杂性作用。

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