华法林药物基因组学的发展及其临床应用前景

吴 炯，邬升超 综述，郭 玮，潘柏申 审校

(上海复旦大学医学院附属中山医院检验科，上海200032)

华法林是用于防治静脉和动脉血栓栓塞性疾病使用最为广泛的抗凝药物，主要适用于心脏瓣膜置换、房颤、深静脉血栓和肺栓塞患者。华法林是一种消旋混合物，由两种具有光学活性的同分异构体R型和S型等比例构成[1]。稳定状态下R-华法林的浓度是S-华法林的2倍，而S-华法林的抗凝作用则比R异构体强5倍。华法林价格低廉，小剂量即可起效，一旦发生用药过量，使用维生素K可逆转。华法林的临床疗效和不良反应个体差异很大，剂量难以掌握，如剂量不足会导致血栓，剂量稍大则会引起出血。对华法林天然耐药的患者为达到理想的抗栓效应，通常需要应用常规剂量的5～20倍[1]。对于华法林药效的影响的研究热点集中在遗传药物基因组学，但除此之外华法林的药效学还受其它如合并药物(胺碘酮)、饮食习惯(高维生素K饮食)、凝血因子相关遗传性疾病等一系列因素的影响。目前临床多用定期监测国际标准化比值(INR)和凝血酶原时间(PT)的方法监测其药效，及时调整剂量。

一、华法林代谢及作用原理

R-华法林的代谢主要是由细胞色素P450酶家族中的酶3A4、1A2和1A1完成。同工酶3A4可以代谢R-华法林，催化其成为无活性形式的10-羟基华法林。由于肝源性的细胞色素P450酶中，同工酶3A4占有很高的比例因此被认为是与R-华法林异构体代谢主要相关的酶类。S-华法林代谢主要是由细胞色素P450酶家族中的酶2C9完成，它可以代谢约80% ～85%的S-华法林，催化其成为无活性形式6-羟基或7-羟基华法林。约有45%的华法林最后代谢成为7-羟基华法林，参与该代谢途径的细胞色素酶仅有细胞色素P450酶2C9(CYP2C9)[2]。由于华法林的抗凝作用主要由S-华法林贡献，因此同工酶2C9的活性对华法林的抗凝效果产生显著影响。华法林作用于维生素K环氧化物还原酶复合体1(VKORC1)上，通过影响维生素 K循环代谢中的限速酶VKORC1的活性而起到在体内的抗凝作用。VKORC1活性直接决定了华法林的抗凝效果。

二、华法林相关基因

多项研究表明，华法林相关基因的单核甘酸多态性(SNPs)与个体所需华法林剂量有关，并与华法林使用过程中抗凝不足或者出血等副作用的发生相关。华法林药物基因主要可以分为两类，首先是与华法林作用代谢和作用靶点相关的基因，如CYP2C9和VKORC1等;其次是与体内维生素K1代谢循环相关的基因，如GGCX、CYP4F2、EPHX1、APOE等。上述酶类在华法林代谢和维生素K循环的作用见图1。

1.CYP2C9 CYP2C9是编码细胞色素P450酶2C9的基因，位于染色体10q24.2，全长55kb，由9个外显子组成。由于CYP2C9编码的酶2C9主要负责代谢华法林，CYP2C9基因突变可引起代谢华法林能力降低，降低所需的华法林使用剂量。目前报道最多的SNPs是野生型CYP2C9*1，突变型 CYP2C9*2(rs1799853)和 CYP2C9*3(rs1057910)。Lindh等[3]2009年针对 CYP2C9不同基因型对华法林维持剂量的影响进行Meta分析，较之于CYP2C9*1/*1型，携带CYP2C9*1/*2、CYP2C9*1/*3、CYP2C9*2/*2、CYP2C9*2/*3和CYP2C9*3/*3型的患者所需的华法林剂量分别要低 19.6%、33.7%、36.0%、56.7% 和78.1%。Sheng-Wen Huang 等[4]在针对中国汉族人群研究VKORC1和CYP2C9的基因多态性对于华法林剂量影响的研究中发现，基因型为CYP2C9*1/*3的患者平均每日华法林剂量为(1.72 ±0.55)mg/day，较之CYP2C9*1/*1 患者(3.09 ± 1.14)mg/day，其剂量要低 44.3%(P ＜0.001)，唯一的CYP2C9*3/*3型患者其平均每日华法林剂量仅为0.625 mg/day。CYP2C9的基因多态性分布存在种族差异，高加索人群中等位基因*1、*2和*3的频率分别为83%、12%和5%，非洲人群97%、1%和2%，日本人群95%、0%和5%，而Miao等[5]对178例中国汉族人群的研究中发现该频率分布为95.5%、0%和4.5%，即*1/*1、*1/*3 和*3/*3 患者分别为 162、16和0。在用药初始阶段，CYP2C9的多态性会引起2～3倍发生出血的概率[6]，在长期服用华法林的患者中并没有出现以上现象。这提示在初始阶段对于患者CYP2C9的SNPs的检测有利于更好的防止出血事件的发生，但CYP2C9在初始阶段对于华法林剂量的影响程度要小于VKORC1。

2.VKORC1 VKORC1是编码维生素K环氧化物还原酶复合体1的基因，位于染色体16p11.2，全长11Kb。VKORC1作为维生素K代谢循环中的限速酶，是华法林在体内作用的靶点，其编码基因VKORC1的多态性会引起人体对于华法林的抵抗。Yang等[7]在针对VKORC1多态性分布和对于华法林剂量的影响进行了Meta分析，结果显示VKORC1 1173 C＞T的分布同样存在种族差异，高加索人群中等位基因 TT、CT、CC的频率分别为16.3%、46.9%、36.8%，日本人群 84.9%、15.1%、0%，Jiang等[8]对102例中国汉族人群的研究中发现基因分布频率分布为 81.4%、15.7%、2.9%。针对初始阶段基因多态性对于华法林用药患者的研究表明，VKORC1 1639携带AA型的患者较之于GG型可以更快的进入治疗窗(INR≥2，P＜0.01)以及更低的稳定剂量(P＜0.01)，但发生INR＞5的人数要高(P＜0.001)，初始治疗期(1个月)内易发生出血事件(P ＜0.01)[9]，VKORC1 在华法林治疗初期起着重要的影响作用。

3.CYP4F2 CYP4F2是编码细胞色素P450家族酶4F2的基因。细胞色素P450酶CYP4F2是一种氧化酶，主要负责代谢体内维生素K1。其代谢产物为含有羟基的维生素K1。Matthew G.Mc-Donald等[10]的研究显示通过筛查细胞色素酶，该代谢产物仅能通过CYP4F2的催化来产生。因此编码CYP4F2的基因发生突变引起的酶活性的变化，会使体内维生素K含量的上升，最终导致华法林剂量的增加，目前和CYP4F2相关的SNP位点主要有 CYP4F2 V433M(rs21086222)。Cen 等[11]以222名中国汉族心脏瓣膜置换手术的患者为对象，研究CYP2C9*3，VKORC1和CYP4F2 V433M对于华法林稳定剂量的影响，CYP4F2 V433M突变型患者的稳定剂量为3.3 mg/day，要高于携带野生型等位基因 CC 的患者(CC，2.9 mg/day，P ＜ 0.05)。Danese等[12]针对 CYP4F2 V433M 的 Meta分析中提出CYP4F2 V433M的多态性和个体间华法林维持剂量的差异相关，携带T等位基因的患者所需抗凝药物剂量高于纯合子 CC型患者(8.3%，P＜0.000 1)，但是其对于华法林剂量的影响要低于VKORC1和CYP2C9。

4.GGCX γ-谷氨酰基羧化酶是由GGCX基因所编码的一种定位于粗面内质网和高尔基体上完整的微粒体膜酶，可使维生素K依赖性的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ以及蛋白 C、S、Z 上的 γ-谷氨酸残基发生羧化，成为有活性的凝血因子参与凝血功能。当γ-谷氨酰基羧化酶的活性发生变化，会直接引起凝血因子活化异常，最终导致所需华法林的剂量升高。主要报道的SNPs位点是GGCX 3261 G＞A(rs12714145)和 rs699664(p.R325Q)。Huang等[13]以212名服用华法林的中国汉族人为对象，研究GGCX 3261 G＞A基因多态性和华法林稳定剂量的关系发现，84名携带GG型患者所需华法林剂量为(2.69±1.07)mg/d，显著低于 16 名携带AA型等位基因的患者(3.39 ±1.40)mg/d，P=0.027。该突变可解释2.3%个体间华法林差异。

5.EPHX1 微粒体环氧化物水解酶，是维生素K环氧化物还原酶的另一个亚单位，由EPHX1基因编码。文献报道该类酶具有维生素K环氧化物的 1个结合位点。Wadelius等[14]学者对于EPHX1 rs4653436在201名高加索人群中进行了研究，发现该位点与个体间华法林用药差异具有相关性。Gu等[15]学者在127例中国汉族人群中验证，GG、GA和AA型的人数分别为69例、53例和5例，并且发现华法林维持剂量存在明显差异，AA型华法林稳定剂量为(2.2±1.1)mg/d，GG和GA 型为(1.8 ±0.6)mg/d(P ＜0.05)。国内外学者针对该基因其他SNPS的研究还有EPHX1 rs1877724、rs2292566，但是针对中国汉族人群的研究主要集中在EPHX1 rs4653436。

表1 中国汉族人群华法林相关基因SNPs分布情况

三、华法林基因多态性的检测

临床上对于华法林基因多态性检测的要求除了检测结果的准确性之外，TAT和检测费用是非常重要的2个方面。对于临床实验室，选用的基因多态性检测方法决定了检测仪器、试剂和耗材的选用，最终直接和上述标本周转时间(TAT)和检测费用相关。目前国内外对于华法林基因多态性检测的位点主要有CYP2C9*2(rs1799853)、CYP2C9*3(rs1057910)、VKORC1 1173(rs9934438)和 VKORC1 1639(rs9923231)。常规使用的检测方法包括有直接测序法、高分辨熔解曲线(HRM)[26]、TaqMan 探针法和限制性片段多态性长度(PCR-RFLP)等。其中TaqMan探针法和直接测序法是国内外使用较多的2个检测方法，TaqMan探针法的优点是检测快速，标本从收到全血到检验报告的发出在2 h内可以完成，但是其检测费用较直接测序法要高。另一种方法是突变特异性扩增系统(ARMS)，其优点包括方法灵敏且特异度好对于仪器和试剂的要求均较低，同时方法简单，快捷。国内已经有学者建立了AMRS法对患者的华法林相关基因多态性进行检测[27]。

四.华法林基因多态性的临床应用

传统的经验化给药方式的弊端在于需要多次检测INR，并根据结果改变相应的华法林剂量，以至于长时间无法达到治疗窗或易发生出血事件。因此美国国家食品和药品监管局(FDA)先在2007年在华法林药品处方信息上添加了基因对于药物疗效的影响，之后于2010年修订华法林的药物处方信息，将基因对于华法林药效的影响纳入到考虑范围内，提出医师可以为患者提供基因检测的机会，并提供了基于VKORC1和CYP2C9 2个基因的华法林剂量表格。上述措施均旨在强调基因对于华法林药效的影响。近年来，许多研究团队通过将基因型连同其它相关影响因素一起，建立了基于药物基因组学的华法林剂量公式，并且以不同的方式包括前瞻性的随机抽样验证和回顾性的验证，就剂量公式的临床价值进行了评估[29-30]。

图1 华法林抗凝作用机制与维生素K1体内循环示意图

2005 年 Sconce等[28]建立以年龄、身高、VKORC1和CYP2C9为影响因素的剂量公式“剂量=0.628-0.013 5(年龄)-0.240(CYP2C9*2)－0.370(CYP2C9*3)－0.241(VKORC1)+0.016 2(身高)”，这可以解释约55%个体间华法林维持剂量的差异(R2=0.55)，作者通过回顾性研究的方式评估了该剂量公式的临床价值，其预测的维持剂量和实际维持剂量具有很高的相关性(r=0.80，P＜0.001)。2009年Huang等[4]通过研究266 名中国汉族服用华法林剂患者基因多态性及其他相关因素对华法林维持剂量的影响，建立了基于VKORC1和CYP2C9的剂量公式，线性回归模型可以解释54.1%个体间华法林剂量差异。随后针对156名中国汉族患者通过随机分组的方式，对剂量公式进行了前瞻性验证，结果显示当患者华法林用药剂量稳定后，2组间华法林剂量呈现出相关性(R2=0.454，P ＜0.001)。随后在 2012 年 Wang 等[30]通过将101例中国汉族的心脏瓣膜置换的患者分为2组(实验组50名，对照组51名)，实验组按照Huang等[4]建立的剂量公式进行，对照组以传统给药方式给药，研究周期为50 d。结果显示实验组相对于对照组患者可以更快地从初始服药阶段进入维持剂量的服用阶段[实验组(27.5±1.8)d，对照组(34.7 ±1.8)d，P ＜0.001]，且2 组间华法林的维持剂量呈现出较好的相关性(r=0.684，P＜0.001)。2次前瞻性研究均给出了理想的结果，提示基于药物基因学的剂量公式可以更好的指导华法林的使用。

上述针对华法林初期治疗的前瞻性研究中，所给初始剂量都是基于维持剂量公式而计算得出的，而华法林用药过程中，出血或者抗凝不足等不良事件往往发生在用药初期，对于临床而言初始剂量尤为重要。2011年Gong等[29]针对初次用药患者以建立的“WRAPID”初始剂量公式进行了前瞻性研究，“WRAPID”包含了负荷剂量表格和维持剂量公式，其中负荷剂量即指在第一次服用华法林时给药的剂量。该研究按照基于基因型的剂量表格在初次服药的前2 d进行给药，在给药时按照不同的体重也对给药剂量进行了矫正。最后结果说明“WRAPID”公式可以更好地为房颤和深静脉血栓患者在服用华法林时提供帮助。这是迄今针对初始华法林用药较为全面的1次前瞻性研究，但“WRAPID”中负荷剂量表格并没有将年龄，或者其他相关基因的SNPS列为影响因素。

基于药物基因学的剂量公式的建立，主要囊括了VKORC1，CYP2C9 2个基因的多态性位点和其他相关因素。但是由于许多其他基因如CYP4F2、EPHX1、GGCX等基因的多态性同样会影响个体间华法林剂量的差异，因此也有许多研究将以上基因一同纳入到剂量公式中，旨在更好地估计华法林剂量。Gu等[15]以127名中国汉族人群为对象，研究基因多态性及其他因素对于华法林维持剂量的影响。所涉及的基因包括VKORC1和CYP2C9外，还增加了EPHX1基因的1个多态性位点EPHX1 691A＞G(rs4653436)。通过多重线性回归建立的模型包含年龄、体重、VKORC1-1639G＞A、EPHX1691A＞G、CYP2C9*3和CYP2C9 IVS3-65G＞C等影响因素，最终可以解释76.8%个体间华法林剂量差异(R2=0.768)。

虽然华法林基因剂量方程的研究取得了不小的进展，但对于其临床应用依然存在争议。部分学者对于将华法林药物基因学研究的临床价值持乐观态度。他们认为虽然使用之前纳入年龄、体重、患病史、药物和食物的影响的剂量方程可以缩短患者服药后达到有效治疗范围(INR值控制在1.8～3.0之间)的时间[31]，但是通过将已经被公认和华法林剂量相关的CYP2C9和VKORC1基因的多态性一同列入到剂量方程，可以更好的指导患者在用药初期避免抗凝过量的发生。据文献报道，如果将基因型的检测一同列入到华法林治疗过程中，并按其结果指导用药，美国服用华法林的患者每年可以避免4 500～22 000例严重出血事件的发生[32]。

但是有待解决的问题还是存在的，首先是如今的华法林剂量公式只能解释50%高加索人种的个体用药差异，对于亚洲和非洲人群，其所能解释的程度要低很多，因此剂量公式中也许需要纳入新的影响因素。另外，如何将建立的维持剂量公式作为初始剂量公式进行使用仍旧没有定论，许多前瞻性研究均直接以维持剂量公式计算的结果作为初始给药的剂量，其可行性尚未得到论证。最后要推广以华法林药物基因学为指导的给药方式，需要更大规模的临床实验去验证其可靠性。无论是支持用药前进行基因多态性检测的学者还是反对的学者均一致认为在初始阶段基于药物基因学的华法林剂量公式对于防范出血或者血栓形成发生的临床价值有待更多随机、大样本、多种族的前瞻性研究去论证[33-34]。如果最后临床验证结果是可行的话，那么基于药物基因学的华法林剂量公式将有效改善口服抗凝药物的药物治疗安全性和成本效益

总之，在诸多耐药相关基因中，华法林相关基因是研究较为多的1项，最有望成为个体化治疗的切入点。但目前研究多以高加索人群为主，国内研究也多以维持剂量的回顾性研究较多，涉及基因不全面，没有涵盖初始及维持剂量的基因—剂量方程及前瞻性验证。仍需进一步的研究，更有效、安全地为中国服用华法林的患者合理使用华法林提供帮助。

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