荧光定量PCR在实验室室间质控中的应用

卢国钧，潘蕙笙，吴金宏，刘锐

(广州铁路疾病预防控制中心，广东广州 510010)

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 材料来源

2009—2012年我中心参加铁道部室间质控和广东省CDC实验室比对试验的考核样品。

1．1．2 试验仪器

ABI 7500F型实时荧光定量PCR仪。

1．1．3 试剂

PCR试剂均购自深圳生科源技术有限公司。

1．1．3．1 小肠结肠炎耶尔森氏菌检测试剂盒(单色实时荧光PCR法)。

1．1．3．2 沙门氏菌、志贺氏菌检测试剂盒(双色实时荧光PCR法)。

1．1．3．3 大肠杆菌 O157、单增李斯特菌检测试剂盒(双色实时荧光PCR法)。

1．1．3．4 金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒(双色实时荧光PCR法)。

1．1．3．5 蜡样芽胞杆菌检测试剂盒(单色实时荧光PCR法)。

1．1．3．6 霍乱弧菌、副溶血弧菌检测试剂盒(双色实时荧光PCR法)。

1．1．3．7 空肠弯曲菌检测试剂盒(单色实时荧光PCR法)。

1．2 方法

1．2．1 样品处理(DNA提取)

样品在室温静置5 min，取1 mL上清液加入到1．5 mL无菌离心管中，12 000 r/min离心5 min后弃上清，保留沉淀;每管沉淀中加入DNA提取液50μL，将沉淀悬浮后100℃加热处理5 min;12 000 r/min离心5 min取上清液进行PCR检测。

1．2．2 PCR 扩增与检测

取n个(n=待测样品+阴性对照+阳性对照)0．1 mL PCR反应管，每管分别加入要检测项目的试剂盒中的PCR反应液19．5μL和混合酶液0．5μL，混匀后，2 000 r/min 离心 10 s;于上述PCR反应管中分别加入待测样品DNA提取液、阳性对照和阴性对照各5μL。将PCR反应液与样品DNA提取液振荡混匀后2 000 r/min离心10s，放入PCR仪中。

信号采集:双色荧光PCR法试剂盒应用FAM和JOE二个通道采集荧光信号;单色荧光PCR法试剂盒应用FAM通道采集荧光信号。

仪器设置循环条件如下:50℃ 2 min，1循环;95℃ 3 min，1循环;95℃ 5 s→55℃ 60 s(收集荧光)，40循环。

1．2．3 质量控制

每次实验均设阴、阳性对照。阳性对照:Ct值≤25，有明显指数增长期。阴性对照:Ct值＞35或无Ct值，曲线无指数增长期。

1．2．4 结果判定

样品检测结果Ct值≤30，且有明显指数增长期，可判样品为阳性;样品检测结果Ct值＞35或无Ct值，可判样品为阴性;样品检测结果Ct值在30～35范围时，应对样品进行重复检测，特别是双色试剂盒出现Ct值在30～35时，应改用单色试剂盒重新检测。

2 结果

自2009年到2012年我中心参加了铁道部室间质控和广东省CDC实验室间比对试验活动，在考核过程中，既应用传统分离培养方法(参照《食品微生物学检验 沙门氏菌检验》GB4789．4—2010、《食品卫生微生物学检验 志贺氏菌检验》GB/T4789．5—2003、《食品卫生微生物学检验 副溶血性弧菌检验》GB/T4789．7—2008、《食品卫生微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验》GB/T4789．8—2008、《食品卫生微生物学检验 空肠弯曲菌检验》GB/T4789．9—2008、《食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》GB4789．10—2010、《食品卫生微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》GB/T4789．14—2003、《食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》GB4789．30—2010、《食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验》GB/T4789．36—2008)，也应用了荧光定量PCR法对考核样品进行检测，表1是应用荧光定量PCR法对质控和比对样品进行检测的结果，其中部分考样为混合菌株。

表1 荧光定量PCR法室间质控检测结果

以上检测结果与传统分离培养方法检验结果是一致的，与铁道部和广东省CDC反馈的考核结果完全相符，符合率100%。

3 讨论

双色荧光定量PCR试剂应用2种待测致病菌特异基因引物和改良分子信标探针设计［1，2］，可同时检测2种致病菌，如沙门氏菌和志贺氏菌、大肠杆菌O157和单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌、霍乱弧菌和副溶血弧菌等;单色实时荧光定量PCR试剂应用一种待测致病菌特异基因引物和探针，可分别检测致病菌，如小肠结肠炎耶尔森氏菌、蜡样芽胞杆菌和空肠弯曲菌等。本文通过应用荧光定量PCR法对质控和比对样品进行检测，检测结果与考核结果一致，因此笔者认为，荧光定量PCR可作为快速初筛和与传统分离培养方法相互印证的检验工具，当二者鉴定结果一致时，可信度非常高。荧光定量PCR检测时间短，几个小时即可得出结果，根据荧光定量PCR的检测结果，可以有的放矢，着重对该菌的鉴定。当考核样品是混合菌株时，荧光定量PCR的作用更为突出，可先用荧光定量PCR进行检验，然后用传统分离培养方法对荧光定量PCR阳性菌株进行确认，这样可以节省检验时间，最后将精力集中于荧光定量PCR阴性菌株上。另外，传统分离培养方法在检验混合菌株时，如果其中一个菌株的菌量不足或受其它菌干扰，造成菌落生长不良、不典型或不生长，容易出现漏检情况。而荧光定量PCR由于灵敏度高，不受培养条件限制，反而容易检出，据报道［1，］，菌液灵敏度为 32～64CFU/mL或1～2CFU/PCR反应体系，无交叉反应。当荧光定量PCR检出，而传统分离培养方法未检出时，需要考虑2种情况:(1)目标菌株死亡，也可能是某些细菌，如副溶血性弧菌，不耐冻而死亡。如2009年比对试验，基质为冻干菌种，其中副溶血性弧菌不耐冻而死亡，多个参与考核的单位没有检出。(2)目标菌株菌量过少，生长不良、不典型或不生长，这需要考虑培养方法和条件是否需要更改，如培养基、培养温度和培养时间等。另外对于平常检验较少、考核时把握性不大的菌株，荧光定量PCR可以起到重要的提示作用，如2010年和2012年铁道部质控考核，小肠结肠炎耶尔森菌和蜡样芽胞杆菌鉴定，这2个项目日常检验较少，此时荧光定量PCR可以起到很好的提示作用。

4 结论

在多次的实验室室间质控和比对试验中，将荧光定量PCR应用于菌株的鉴定中，均收到了良好的效果。荧光定量PCR法既可以缩短检测时间，极大地提高了工作效率，又可以提高检测的灵敏度和准确性，值得推广应用。

［1］ 石晓路，扈庆华，张佳峰，等．多重实时PCR快速同时检测沙门菌和志贺菌［J］．中华流行病杂志，2006，27(12):1053-1056．

［2］ 吴海娟．实时荧光PCR快速同时检测从业人员沙门菌和志贺菌结果分析［J］．现代预防医学，2013，40(12):2323-2325．