胶原蛋白在化妆品中的应用研究新进展

胶原蛋白的概念

胶原蛋白是一种生物性高分子物质，占人体全身总蛋白质的25%～30%，广泛地存在于人体的皮肤、骨骼、肌肉、软骨、关节、头发组织中，起着支撑、修复、保护三重抗衰老作用。胶原蛋白的特性决定了其在化妆品上的优良功效，具有良好的应用前景。

1.胶原蛋白的来源

一般来说，胶原蛋白的主要来源是陆生动物，如猪、牛、羊等，主要分布于生皮中，其次是骨头和肌肉中。脊椎动物体内的胶原蛋白量是结构蛋白的主要成分，是结缔组织和支持组织的主要组成部分。近年随着疯牛病、口蹄疫等疾病的肆虐和一些宗教信仰等原因，使得人们对于牲畜胶原制品的安全性产生质疑，所以作为牲畜替代原料的水产动物—鱼类引起了人们的广泛关注。

对于鱼类中胶原蛋白的提取，其实主要可利用鱼的下脚料，它有三大优势：第一，鱼胶原的可溶性比陆生动物高，更有利于组织吸收[1]，且其抗原性和过敏性较低，分子结构较脆弱方便酶解[2]，故从鱼中提取胶原蛋白较从其他动物中提取工艺更简单，节约成本；第二，研究表明，由鱼下脚料中提取的胶原蛋白所制得的多肽分子量大部分都在1000D以下，对皮肤的渗透性好，下脚料中鱼皮的胶原蛋白含量最高可达80%以上，较鱼体其他部位高许多[3]，因此从得率考虑，从鱼皮中提取胶原蛋白具有重要的经济意义；第三，充分利用鱼类加工的副产品，这是一种新型胶原资源的开发，不仅节约资源而且增加其附加值，胶原蛋白的回收率更是高达90%以上。刘克海、秦玉清[4]等研究表明，从鱿鱼皮中提取的胶原蛋白保湿率明显高于丙二醇和甘油。

2.胶原蛋白的基本结构

胶原蛋白在体内以胶原原纤维的形式存在，其基本组成单位是原胶原分子，微观结构如图1所示。胶原蛋白的分子量为300KD，它是由3条左手螺旋的a肽链组成，这3条链相互缠绕形成右手螺旋结构。另外，肽链间的范德华力、氢键和共价交联键是维持胶原三股螺旋结构稳定的主要作用力[5]。

A—电镜下胶原纤维呈明暗交替的条纹图案；

B—胶原纤维中胶原原分子的排列；

C—原胶原分子式一种右手三股螺旋；

D—三股螺旋中的每股链是左手螺旋；

E—三股螺旋的原分子水平模型

胶原一级结构（肽链）均为（Gly- X-Y）重复序列，其中甘氨酸约占氨基酸总量的1/3，其次是胶原所特有的脯氨酸和羟脯氨酸，含量高达15%～30%，色氨酸、酪氨酸及蛋氨酸等必需氨基酸含量低[7]。胶原蛋白良好的保湿性能就是源于其所富含的大量氨基、羧基、羟基等亲水基团。

3.皮肤中的胶原蛋白

胶原蛋白位于皮肤的真皮层，含量约为70%，主要包括Ⅰ型（85%）、Ⅲ型和Ⅴ型，这三类都属于纤维状胶原，它们相互交叉形成网状结构，使皮肤具有很强的抗张性和弹性[8]。而皮肤衰老的主要原因就是随着年龄的增长，蛋白质结构发生变化，皮肤含水量逐渐降低，纤维细胞的合成胶原蛋白能力下降。皮肤中一旦缺乏胶原蛋白，胶原纤维就会发生交联固化，使细胞间粘多糖减少，皮肤就会失去弹性并变薄老化。另外，皮肤中胶原蛋白还会受到生活习惯、外界环境（如紫外线）的影响，紫外线会促进皮肤老化，并且人的体内会发生氧化作用，胶原蛋白的弹性纤维结构会因自由基的攻击产生变形从而失去原有的弹性，皮肤就会变得粗糙并产生皱纹[9]。

胶原蛋白在化妆品中的功效

将胶原蛋白添加到化妆品中，能为皮肤提供必需的营养成分，其所含大量的亲水基团使之具有良好的保湿功效，另外，胶原蛋白还能起到稳定泡沫、调节和稳定pH值、乳化胶体的作用，减轻各种表面活性剂及酸、碱等刺激性物质对皮肤和毛发的损害[10]， 胶原蛋白在化妆品中的显著功效主要体现在以下几个方面[11]。

1.保湿

因为胶原蛋白与皮肤角质层的结构相近，故与皮肤有很好的相容性，能渗透进皮肤表皮层，胶原蛋白中含有的大量亲水基团与角质层中的水结合，形成网状结构，锁住水分使之具有良好的保湿功效，起到天然保湿因子的作用。

2.抗皱

皱纹之所以出现主要是因为皮肤真皮层中胶原蛋白含量的减少，小分子量的胶原蛋白能透过皮肤表皮层，在皮肤基质中起到填充作用，增加皮肤张力，使得肌肤更有弹性，舒缓皱纹。

3.美白

人的皮肤颜色主要是由黑色素的分布与含量决定的。黑色素的主要成分是醌型聚合物，黑色素产生的原因是酪氨酸酶与皮肤中的酪氨酸反应，生成多巴醌，释放出黑色素。化妆品中添加的胶原多肽的酪氨酸残基会与皮肤中的酪氨酸竞争与酪氨酸酶的活性中心结合，从而抑制酪氨酸酶催化酪氨酸，阻止皮肤中黑色素的形成，达到美白作用[9]。

4.修复

胶原蛋白还可以用来皮下注射，起到支撑和填充的作用，并提供良好的营养，有利于上皮细胞的增生修复，从而诱导皮肤组织的构建，促进创面愈合，起到矫形的作用。同时也可用于减少皱纹和消除皮肤疤痕，使疤痕软化，并能逐渐被组织吸收而消退。

胶原蛋白的水解方法

胶原蛋白本身的分子量很大，用于化妆品时需将其水解成小分子量的多肽才能被皮肤吸收，因此胶原蛋白的水解方法适当对胶原蛋白的功效就显得十分重要。研究表明，对化妆品中的胶原蛋白水解物分子量的要求一般为1000～5000Da，平均分子量为700～1000Da时效果最佳；分子量为2000左右的水解物能被头发充分吸收，效果最好。可溶性胶原能在皮肤上形成光滑、柔和的膜，从而不仅具有吸

湿性而且能够抑制水分挥发[12]。胶原水解一般有两种方法：使用酸、碱的化学降解法和使用酶的生物降解法。

1.酸法提取

酸法提取即利用酸浸泡预处理后的材料，使胶原蛋白部分降解后释放到溶剂中，再通过离心等操作提纯的方法。常用的酸有乙酸、草酸、柠檬酸、盐酸和乳酸等，胶原水解产物的分子量随水解温度、酸的浓度和水解时间等条件的不同而不同。该法的优点是水解迅速彻底，分子量分布广；缺点是在水解过程中色氨酸全部被破坏，酪氨酸和丝氨酸部分被破坏，产品得率低且腐蚀设备、污染严重[13]。

2.碱法提取

同酸法提取类似，碱法提取不过是用碱溶解预处理后的材料从中提取胶原。胶原水解物的分子量受水解温度和时间、碱的浓度等条件的影响而不同。该法的优点是操作简便；缺点是使胶原中含巯基和羟基的氨基酸全部被破坏且产生消旋而变成有毒物质，提取率较其他提取方法低[14]。Kolodziejska等[15]用NaOH从鱿鱼皮中提取碱溶性胶原蛋白，得率只有3%（以湿基计）。

3.酶法提取

酶法提取是在预处理后的材料中加入酶制剂，即用蛋白酶来溶解胶原从而达到提取的目的，水解原理如图2所示。常用的酶有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶以及复合酶等。对酶的选择通常要考虑两个因素，一是酶对胶原作用的强弱及酶的价格，另一个则是酶对胶原的作用位点（按作用点不同可分为内切酶和外切酶），这将直接影响到水解产物的分子量分布。目前酶解胶原蛋白主要有单酶水解和多酶水解两种方法，后者又分为分步酶水解和混合酶水解，多酶水解则适用于获取较小分子量的胶原多肽[16]。影响酶法提取的主要因素有酶的种类和用量、液料比、pH值、水解时间以及水解温度。另外，由于酶的专一性，酶解产物的分子量不是连续分布，主要集中在一个较窄的区域，故选择适当的酶和工艺条件，理论上可以得到预期相对分子质量的水解产物。多酶协同和混合交替法可实现胶原的高效定向水解，并能最大程度地保留产物的生物活性，故此法是胶原控制水解的一个重要发展方向[17]。韩凤杰等[18]用2709碱性蛋白酶处理比目鱼皮胶原，得到其胶原寡肽分子量主要分布在0.6～1.8KD。Cabeza L F等人[19]用两步酶法（先用胃蛋白酶提取，再用碱性蛋白酶提取）提取两种不同的胶原水解产物。

化学降解法由于自身的诸多缺点如腐蚀设备、破坏氨基酸、改变产物结构等而被逐渐淘汰，而酶法因其特有的选择性、无污染性、条件温和、提取的胶原蛋白性质稳定且分子量较小等而被广泛采用。

胶原水解产物分子量的检测

事实上胶原水解产物的成分比较复杂，分子量分布较广，包括大分子的蛋白质和小分子的氨基酸、多肽等，因此人们对胶原多肽分子量的控制手段以及分子量的检测方法给予了高度关注，将现代分析检测方法用于胶原蛋白的水解过程，成为胶原蛋白应用研究的一个重要方面。

1.凝胶过滤色谱法（GPC）

凝胶色谱法是根据溶剂分子尺寸的不同进行分离的一种液相色谱法，以水作为流动相，分子的分离在填充有一定孔径范围的多孔凝胶的色谱柱中进行，利用高分子溶液通过该色谱柱时将聚合物分子按尺寸大小进行分离，分子按从大到小的顺序排出，再逐步被检测器测出[21]。分子量的测定范围随着凝胶的不同而不同，从几千到几千万。A Ritter[22]等使用 GPC（SEC）法通过循环测试程序测试了六种不同物质的平均分子量，其测定结果重复性很好。

2.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

（SDS-PAGE）凝胶电泳法

SDS-PAGE法的原理是SDS与胶原蛋白的疏水部分充分结合，破坏其折叠结构，形成棒状的带负电荷的蛋白质-SDS胶束，使胶原蛋白能稳定存在于广泛均一的溶液中，故该法是根据蛋白质的分子形状和大小来进行分离[23]。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系：lgM=k-bx，其中M为分子量，x为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。Cohen等[24]采用SDS- PAGE分离和测试蛋白质和多肽的分子量。该法由于对样品需求量较大、操作过程繁琐、重现性较差等原因而逐渐被其他先进技术所取代。

3.高效液相色谱与电喷雾-质谱联用技术（HPLC-ESI-MS）

ESI是通过强电场使分子分离，ESI/MS谱峰的积分强度与样品在溶液中的浓度成正比，所以从质谱图上也可以获取各组分的相对含量[25]。电喷雾质谱适宜测10～200kDa分子量范围的蛋白质，且只需Pmol量的蛋白质样品，不仅快速灵敏，而且测量精确度高（0.1%～0.01%），Green等[26]采用ESI-MS对质量差别很小的蛋白质分子进行区分和检测，显示了质谱技术在蛋白质分子测量上的优势。但它的测定成本相对较高，故不宜用做实验室的常规检测。

4.多角度激光光散射-凝胶渗透色谱法

（MALLS/GPC）

该法先是将高分子物质用凝胶渗透色谱仪进行分离，再通过浓度检测器和多角度激光光散射检测器同时检测出各组分的浓度和分子量，将两者的信号输出并用记录仪记录后即得各组分的绝对分子量和反映分子量分布的凝胶色谱曲线[27]。由于光散射信号与分子量大小直接相关，因此不需要结构相似的标准样品做标准曲线即可以直接测出重均分子量，并获得其他相关信息，故被广泛应用于生物化学、高分子化学等研究领域。理论上GPC-MALLS可以测定的分子量范围很广[28，29]，可达103～107。Hongping Ye[30]利用GPC-MALLS同时测定了蛋白质的聚集、降解和绝对分子质量。它的缺点在于对分子形状要求较高，只有在标样与待测样的分子形状一致时测量结果才较为准确，否则误差较大，因此在不知道蛋白质分子形状时不建议使用。

5.基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法

（MALDI-TOF-MS）

该法原理是当用一定强度的激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量，基质—样品之间发生电荷转移使样品分子电离，电离的样品在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器飞行时间的不同而被检测，即测定离子的质量电荷之比与离子的飞行时间成正比来检测离子。MALDI-TOF-MS的核心技术就是将样品成分转换成离子信号，依据质荷比（m/z）的不同来进行检测，以判断其源自哪一个蛋白质[31]。它具有分辨率高、重复性好、准确度高（0.1%～0.01%）、图谱简明、灵敏度高、样品用量少等传统测量方法无法比拟的优点，适用于混合物及蛋白质等生物大分子的测定，成为许多实验室的首选蛋白质谱鉴定方法，可测定的分子量高达600KD。

纵观以上几种方法的优缺点，结合对添加于化妆品中的胶原蛋白的严格要求，检测胶原蛋白分子量的最佳方法是基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法。

胶原蛋白的研发和应用前景

胶原蛋白在不同性质的化妆品中要求也不同，油性化妆品中添加的胶原多肽要求水解程度较低、分子量较大，这样相对疏水作用较强，具有较好的吸油性和乳化性；保湿型化妆品则需要酶解程度较高、分子量较小的胶原多肽，因其极性基团能形成离子键、氢键等作用力，有较好的吸水性和保水性[32]。如日本Jelice Co. Ltd.公司制备的胶原最小单元胶原三肽（Colagen Tripeptide，简称为CTP），它的平均分子量很小，约为280Da，具有优良的渗透性，能促进真皮层中成纤维细胞中胶原和透明质酸的合成，将其添加于化妆品中，会对皮肤的湿润性、弹性和改善皮肤粗糙产生显著的效果[33]。法国Russelot公司从猪、牛、鱼皮和骨骼中提取并生产的Peptan水解胶原蛋白，它的分子量为2000～5000Da，含有9种必需氨基酸中的8种，其中甘氨酸、羟脯氨酸/脯氨酸和谷氨酸含量非常高，占氨基酸总量的50%以上，不仅应用于化妆品中有良好的功效还可用来口服[34]。北京奥通精细化工高科技公司生产的高纯度的100%纯天然活性蛋白—鲜胶原蛋白，对人体无毒、无刺激、无副作用，安全性极高，是天然化妆品中的高科技产品，代表了生物化妆品的发展方向[35]。

对于添加于化妆品中的胶原蛋白较其他用途的胶原蛋白要求更加严格，包括来源、提取和对分子量的控制。虽然目前胶原蛋白的来源和提取方法已经基本确定，但是对于如何得到更加纯净、安全的胶原蛋白依然是今后的重点研究方向，例如科学家通过基因工程发酵技术合成了类人胶原蛋白，与动物胶原蛋白比较，它的水溶性更好、无病毒隐患、具有可加工性、排异反应低等优点，成为近几年研究热点[36]；还有从蚕丝中提取的全天然纯丝胶蛋白，它具有独特的皮肤保湿、营养、稳定乳化、抗氧化、抗衰老、抗菌消炎等特殊功能，应用前景非常广阔[37]。另外，在胶原蛋白的提取方面，如何提高产率和纯度、缩短提取时间以及过程的绿色化也是未来的研究热点。

作者单位

钱 洁 程宝箴：天津科技大学 材料科学与化学工程学院

王巧娥：北京工商大学 北京市植物资源研究开发重点实验室