泡桐ITS序列测定及特征分析

申响保，乔 杰，李芳东，袁德义

（1.中南林业科技大学，湖南 长沙 410004；2.国家林业局泡桐研究开发中心，河南 郑州 450003）

泡桐ITS序列测定及特征分析

申响保1，乔 杰2，李芳东2，袁德义1

（1.中南林业科技大学，湖南 长沙 410004；2.国家林业局泡桐研究开发中心，河南 郑州 450003）

通过加入乙酸钠优化DNA提取方法，针对泡桐ITS的高GC含量模板，在反应体系中加入DMSO优化PCR反应体系，有效扩增了泡桐ITS序列。采用PCR直接测序和pGM-T载体克隆测序的方法相互验证序列，提高所得ITS序列的准确性，为采用泡桐ITS序列对泡桐的系统发育及遗传多样性等研究提供新的方法。

泡桐；ITS序列；特征分析

泡桐Paulownia俗称水桐、大果泡桐、桐木树等，在我国分布广泛，属广布种。它既是优良的速生用材树种也是常见的绿化造林树种，农桐兼作，用途广泛，因此发展泡桐产业具有重要的经济价值。泡桐属归属于玄参科，毛泡桐P.tomentosa为该属的模式种，大型乔木，但该科的其它属基本上都属于草本植物，因此也有人把泡桐单列为泡桐科。对于属内种的分类，常见的说法是7个种[1]，法国人Dode[2]将7个种分为二组，Sect.Ⅰ.Imperiales Dode（包括毛泡桐P.tomentosa(Thunb.)Steud，光泡桐P. tomentosa va. tsinlingensis(Pai) Gong Tong，兰考泡桐P. elongata S.Y.Hu，楸叶泡桐P. catalpifolia Gong Tong，白花泡桐P.fortunei (Seem.)Hemsl.） 和Sect.Ⅱ.Fortuneana Dode（包括台湾泡桐P. kawakamii Ito，川泡桐P. fargesii Franch，南方泡桐P. australis Gong Tong）。胡秀英[3]认为除上述二组外，应另增设一组Sect. Kawakamia S.Y.Hu。也有人认为现存的许多杂交起源或地理种源的其它泡桐如亮叶毛泡桐、山明泡桐、鄂川泡桐、建始泡桐、成都泡桐、宜昌泡桐、兴山泡桐等也能单独成种。分类学家各持己见，使得基于形态学标记的泡桐属内种间关系仍然模糊。

随着分子生物学技术的发展，不同DNA片段或基因序列分析广泛应用于植物系统分类研究中，其中内转录间隔（Internal Transcribed Spacer，简称ITS）已成为研究被子植物属内种间和较近属间关系中应用最为广泛的序列之一。ITS区是18S-26S核 糖 体 DNA（nuclear ribosomal DNA，nrDNA）转录单位的一部分，包括5.8S亚基，ITS1和ITS2两个间隔区，以串联重复方式多拷贝存在于染色体中，早期的一些研究发现其拷贝间已经完全协同进化[4-5]，因此扩增出泡桐的ITS序列用以厘清泡桐种间关系具有一定的分类学意义。Paul M．Beardsley[6]曾测定过不完整的泡桐ITS序列（Genbank编号：AF478941），600 bp长度的ITS序列中有63个未知碱基，甚至连5.8S都不够完整，这给不同物种序列比对带来困难，仍需准确测定泡桐ITS序列。鉴于ITS序列本身较高GC含量的特征，本研究通过优化PCR反应条件，采取直接测序和克隆测序相结合，进行生物信息学分析得到泡桐属部分物种的ITS序列，以期其能对泡桐属其它种ITS序列的测定有一定的借鉴作用，对分析泡桐属种间系统关系中得到正确可靠的应用。

1 材料与方法

1.1 材料

泡桐来源于国家林业局泡桐研究开发中心在湖北省咸宁市的泡桐种质资源库和江西省共青城县的泡桐种质资源库。实验材料为7月份采摘的成熟叶片，-70℃超低温冰箱保存备用。

1.2 试剂和器材

大肠杆菌感受态DH5α，pGM-T连接试剂盒，PCR产物回收试剂盒，质粒提取试剂盒，Pfu酶，X-gal，IPTG，dNTPs，D2000，D15000 等试剂均来自天根生化有限公司，其它为常规实验试剂。仪器设备主要有ABI Veriti梯度PCR仪，Thermo3410超低温冰箱，泰斯特CJ-1D超净工作台，Microfuge 22R小型高速离心机，各种规格Eppendorf移液器，BIO-RAD Power Pac HV电泳仪，G：BOX-HR凝胶成像系统以及泰斯特202-1AB恒温培养箱等。

1.3 泡桐DNA的提取与检测

泡桐核酸的提取主要参照张延召等[7]的CTABⅡ法，在此基础上有所改良，即在最后一次用无水乙醇沉淀核酸前加入1/10体积的乙酸钠溶液（3M，pH5.2）。检测时用含EB（Et，溴化乙锭）的0.8%琼脂糖做胶，电泳100V，30 min，最后用紫外凝胶成像系统拍照成像。

1.4 PCR扩增

本实验采用ITS的通用引物[8]ITS4和ITS5（序列见表1）。反应体系为去离子无菌水17.25 μL，10×Pfu Buffer 3 μL，dNTPs 3 μL，引物各加 1.5 μL，Pfu Polymerase 0.75 μL，模板 DNA 1.5 μL，DMSO（Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜）1.5 μL。反应程序为预变性94℃5 min，变性94℃30 s，退火60℃35 s，延伸72℃70 s，共35个循环，最后72℃延伸7 min，降至12℃保存。

1.5 PCR产物的检测、克隆与测序

反应产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳，电压为90 V，25 min。持手提式紫外照射仪，设置波长365 nm，检测切胶回收目的条带。用PCR产物回收试剂盒纯化含PCR产物的凝胶，把产物浓缩至30 μL，采用pGM-T连接试剂盒把PCR产物连接至载体。用42度热激的方式将连接好的载体转化至大肠杆菌DH5α感受态中，平板涂抹X-gal和IPTG，37度培养12小时，经蓝白斑筛选，挑选单克隆菌落，摇菌8小时后用质粒提取试剂盒提取质粒，以ITS4和ITS5引物对重组质粒做PCR反应，进行阳性克隆检测。测序是使用ITS4和ITS5做PCR直接测序，同时也用T7和SP6引物（序列见表1）对阳性克隆测序，测序委托上海美吉生物医药科技有限公司，使用的是ABI3730xl测序仪。

表1 实验中所用引物Table 1 Primers used in experiment

2 结果与分析

2.1 高质量DNA提取

高质量泡桐DNA的提取主要困难在于泡桐叶片中含有较高的酚类和多糖类物质。本实验针对酚类物质多加入终浓度4%的β-巯基乙醇抑制酚类在细胞裂解阶段的褐化，另外加入1.4M的氯化钠能有效去除多糖。在DNA提取操作后期，残留的多酚类物质会氧化形成褐色非可溶性物质与DNA结合，此时加入乙酸钠能消除色素杂质，这样的提出的DNA无论纯度跟完整性都比较高。如图：

2.2 PCR优化

图1 改良CTAB法提取泡桐属植物DNAFig.1 Paulownia DNA extracted by modif i ed CTAB method

ITS序列具有许多发夹结构及稳定紧凑的二级结构[9]，聚合酶链式反应时，高GC含量区域的模板在复性过程中易形成二级结构，DNA聚合酶可能会跳跃这些结构从而得到非特异性扩增产物[10]。因此，为得到理想的特异性扩增产物常在反应液中添加解链剂DMSO（Dimethyl Sulfoxide，二甲亚砜）等有机物，它能有效破坏模板的二级结构，降低反应的变性温度，但过量的DMSO亦能抑制聚合酶的活性。因此，适量的DMSO能提高扩增效率和特异性，防止ITS假基因序列的扩增[11]。为优化反应体系，DMSO用量设计了一个浓度梯度实验，即从占比反应液的2%到5%，每个梯度取2个样进行重复，综合扩增效果，最终选用5%的DMSO用量。如图：

图2 DMSO用量比较Fig.2 Amplif i cation effects with different amounts of DMSO

2.3 序列的生物信息学分析

在生物界，高度保守的5.8S区和变异较快的ITS1、ITS2区序列已被公认为是有功能的ITS序列[12]。在被子植物中，5.8S亚基在进化上是高度保守的一段长约164 bp～165 bp的序列，由于ITS拷贝众多，在长期的进化过程中，即使个体内的nrDNA也呈现出一定的多态性，也有部分退化为非功能序列。ITS非功能序列中的5.8S常有不同程度的长度差异，在进化速率上与功能序列不完全一致，在系统发育研究中，不进行真假基因判断可能导致序列取样不准，从而错误评估所研究的系统发育关系，因此利用ITS序列分析时有必要进行序列的功能性分析。

5.8S的完整性和ITS序列中GC含量以及ITS序列的相似性常用于判断真假ITS基因序列的重要指标。本实验选取几种玄参科植物的ITS序列和毛泡桐相比较，采用生物学软件Vector NT1对序列进行分析，结果发现，所得到的泡桐ITS与其它玄参科物种相似性大多在90%以上（见表2）。采用生物学软件Clustal X对序列进行Alignment比较时发现泡桐与其它玄参科物种的5.8S均为165bp，且序列完全一致，也进一步验证了泡桐ITS序列测定的准确性。泡桐ITS长度及GC含量与其它物种大致相近，在GC含量上泡桐要比其它物种高，这也是克隆的困难之处。

表 2 泡桐与玄参科不同属物种序列的相似性Table 2 Simlarity of nucleotide sequences of ITS from Paulownia tomentosa and other some plants in Scrophularia

3 讨论与结论

随着分子生物学的发展，植物DNA的提取方法已经比较成熟，但是由于不同植物的生物学特征，在DNA提取中对通用的提取方法有进一步优化的必要。比如，在泡桐DNA提取过程中加入乙酸钠能有效去除核酸中所含的色素杂质，得比较高质量的泡桐基因组。

被子植物的ITS序列GC含量较高，一般超过55%，而泡桐达到了66%，按常规PCR技术克隆ITS序列较为困难，且ITS还可能存在多态性，因此样品也可能存在非特异性扩增，因此在PCR反应体系中加入适量的抑制剂破坏模板的二级结构，降低变性温度，在克隆泡桐ITS序列时十分有效。虽然能够成功扩增目的产物，但是用PCR直接测序很容易出现套峰，或测序结果无信号，测序的结果很难把握准确，往往需要重复测序，本实验另外通过T载体克隆测序对序列进行相互验证，以求达到准确。

随着近几年国家对林业行业的重视，对泡桐研究投入的增加，在泡桐种源以及遗传多样性研究上取得了一定的进展[13-14]，但是选用的分子标记的准确性随实验人员操作而有一定的误差，如果能以诸如ITS序列等基因组序列来分析系统发育或遗传多样性将极大提高准确性。无论是从泡桐ITS的完整性还是ITS长度及GC含量上分析，本实验方法所得到的泡桐ITS序列是比较准确的。因此，本研究测定出来的ITS序列对于泡桐的研究有一定的意义。

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Mensuration of ITS sequences and characteristics analysis of Paulownia

SHEN Xiang-bao1, QIAO Jie2, LI Fang-dong2, YUAN De-yi1
(1. Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2. Paulownia Research and Development Center of State Forestry Administration, Zhengzhou 450003, Henan, China)

Through optimizing DNA extraction method by adding sodium acetate, taking into account the template with high GC content in the ITS of Paulownia, the DMSO and optimization of PCR reaction system were joined in the reaction system, thereby amplif i ying the ITS sequence of Paulownia. The mutual verif i cation between PCR direct sequencing and pGM-T vector clone sequencing raised the accuracy of the obtained ITS sequences. The results provide a new method for using ITS Paulownia sequences to research phylogeny and genetic diversity of Paulownia provide.

Paulownia; ITS sequence; characteristic analysis

S792.43

A

1673-923X(2013)10-0030-04

2013-03-16

林业公益性行业科研专项“泡桐基因库与育种群体建立技术研究”(200804021)

申响保（1978-），男，湖南邵东人，博士研究生，讲师，主要从事林木遗传育种研究；E-mail：shenxb_2008@qq.com

[本文编校：吴 彬]