无瓣海桑灰霉病病原的分离及药剂筛选

徐金柱，秦长生，杨 华，赵丹阳，揭育泽

(广东省林业科学研究院，广东 广州 510520)

无瓣海桑灰霉病病原的分离及药剂筛选

徐金柱，秦长生，杨 华，赵丹阳，揭育泽

(广东省林业科学研究院，广东 广州 510520)

灰霉病是无瓣海桑育苗过程中的重要病害，是影响其育苗成败的关键因素之一。无瓣海桑灰霉病发病植株经室内分离鉴定为灰葡萄孢。室内采用生长速率法测定了7种杀菌剂对其生长的抑制作用。结果表明，咯菌腈、苯甲、丙环唑和醚菌、啶酰菌对无瓣海桑灰霉病有较好的抑制作用，EC50分别为0.10、0.25和0.14 mg/L，苯醚甲环唑、异菌脲其次(EC50分别为2.28、6.44 mg/L），啶酰菌胺和嘧霉胺抑菌效果较差，低浓度嘧霉对灰霉菌的生长有剌激作用，研究结果为无瓣海桑灰霉病的田间防治提供了依据。

无瓣海桑；灰葡萄孢；杀菌剂筛选

无瓣海桑是我国首个从国外引进并大面积推广种植的红树植物，生长快，适应性强，已成为华南沿海红树林恢复造林的主要树种。引种证明了，无瓣海桑适应我国华南沿海气候条件，在盐度较低的泥质滩涂特别是河流入海口附近泥滩生长良好，具有良好的生态防护效益、环境净化效益和生态控制作用，可作为红树林人工恢复的先锋树种[1-2]。在珠海淇澳岛抑制互花米草Spartina alternif l ora蔓延，恢复红树林方面发挥了积极的作用[3]。

灰霉病是由灰葡萄孢 B. cinerea引起的一种世界性重要真菌病害，对葡萄、草莓等多种农作物的生长产生严重影响，造成花和果实的腐烂。红树植物无瓣海桑在育苗过程中，常受灰霉病的危害[4-5]，主要危害幼苗的幼茎和叶片。幼茎感病部位缢缩变细，最后苗木折倒死亡。叶片感病组织初为不规则块状褪绿，1 周左右便开始枯萎、死亡，发病部位产生褐色霉状物，后期在发病部位产生不规则状黑色菌核。灰霉病的防治多年来一直依赖于化学防治，抗药性已成为灰霉病防治的突出问题。本研究分离了无瓣海桑灰霉病的病原菌并进行鉴定，同时选择了灰霉病防治的几种药剂开展了室内毒力测定，筛选对无瓣海桑灰霉病原菌具有良好抑制效果的杀菌剂，为田间灰霉病防治提供有效的药剂和防治手段。

1 材料与方法

1.1 病原采集分离与鉴定[6]

发病植株采集于广东省珠海红树林保区无瓣海桑苗圃地。无瓣海桑灰霉发病组织采集后，独立保存带回室验室，无菌条件下，用无菌水清洗3次，浸入1%次氯酸钠溶液中30 s，取出后浸入70%的乙醇溶液3～5 min，再转入无菌水中漂洗3次，在病健交接处剪取大约边长为3 mm的小块接入PDA 平板内，每平板内接4～5块，置于22 ℃培养箱中黑暗培养。1～2 d后挑取单菌丝，进行纯化。纯化后的病原菌，转接于 PDA 斜面培养基，4 ℃冰箱中保存、备用。

纯化后的病原菌点接于PDA平板中央，22 ℃下培养5～7 d，取透明胶布在菌落表面轻轻粘上菌丝及产孢结构，滴一滴清水于洁净的载玻片中央，将透明胶布反贴于载玻片上，盖上盖玻片在显微镜下观察产孢结构及孢子大小，进行鉴定。

1.2 7种杀菌剂对无瓣海桑灰霉病的室内生长的抑制作用

供试药剂：50%啶酰菌胺水分分散剂（商品名凯泽，德国巴斯夫），50%咯菌腈可湿性粉剂（商品名卉友，先正达），500 g/L异菌脲悬浮剂（商品名扑海因，拜耳作物科学（中国）有限公司），400 g/L嘧霉胺悬浮剂（陕西上格之路生物科学有限公司），300 g/L醚菌·啶酰菌悬浮剂（商品名翠泽，巴斯夫（中国）有限公司），10%苯甲·丙环唑乳油（永农生物科学有限公司）。根据有效成份含量，分别配制成质量浓度分别为0.05、0.2、0.5、1.5和5 mg/L的PDA平板（D=9 cm），每处理5个重复。

药剂对灰霉病原菌生长的抑制测定：供试菌株在PDA平板上22±1 ℃暗培养3 d，用内径为4.5 mm的打孔器打取菌塞备用。随机取一菌塞，反接于加药的PDA平板上，以不加药的PDA做对照。22±1 ℃暗培养，每24 h测定1次菌落直径。根据菌丝生长抑制机率值和各药剂浓度对数之间的线性回归分析，得出各药剂对灰葡萄孢的致死中浓度（EC50），结合药剂的相对抑制率A=（B－C）/B×100%（A为相对抑制率，B为对照菌落平均直径，C为处理组菌落的平均直径），评价供试药剂对无瓣海桑灰霉病抑制作用。

2 结果与分析

2.1 无瓣海桑灰霉病病原分离及鉴定

培养 3～5 d的灰霉菌落形态特征和产孢结构如图1。显微结构表明，分生孢子梗丛生，直立或稍弯曲，无色至淡褐色，顶端粗大，呈 1～2 次分枝，分枝末端膨大，从膨大体或分枝末端小突起上聚生多数分生孢子，外观呈葡萄穗状，分生孢子椭圆形、球形、卵形，无色至淡灰褐色，单孢，表面光滑，大小为12～18×9～13 um，成堆时淡黄色。在培养基上培养后长出白色放射状菌丝体，菌丝体颜色逐渐加深，后期菌丝体纠集形成近圆形或不规则形的菌核黑色，表面粗糙。根据其显微结构结合平板培养性状，鉴定无瓣海桑灰霉病的病原为葡萄灰霉菌Botrytis cinerea。

图1 无瓣海桑灰霉病的培养性状及显微结构Fig. 1 Culture characteristics and microstrure of B. cinerea from S. apetala

2.2 几种杀菌剂对灰霉病原菌的抑制作用

连续测定了灰霉病原菌接种后5 d的生长量，结果表明，同一种药剂生长速率基本一致。取第3 d的生长量作为比较对象，评价供试药剂对灰霉菌生长速率的影响。经Duncan新复极差分析（见表1），同一药剂不同浓度间差异极显著，生长速率随浓度的增加呈下降趋势，生长抑制率分析表明（见表2），咯菌腈和丙甲·苯环唑表明最好，浓度为1.5 mg/L时即可完全抑制葡萄灰霉病的生长，在较低浓度也有较好的抑制效果；醚菌·啶酰菌表现次之，在浓度为1.5 mg/L时能极大抑制病原菌的生长，与对照相比，生长速率下降了76.4%，浓度为5 mg/L时可完全抑制病原菌的生长；啶酰菌胺，苯醚甲环唑和异菌脲的药效相当，不同浓度组对病原菌生长均有一定影响，但在供试浓度范围内均不能完全抑制病原菌的生长；嘧霉胺表现最不理想，在低浓度时对病原菌的生长还有刺激作用。

表 1 供试药剂不同浓度下灰葡萄孢的生长量†Table 1 Increments of B. cinerea with different dose of tested fungicides (mm/3d)

表 2 供试药剂对灰葡萄孢的相对抑菌率Table 2 Relative inhibition rate of tested fungicides to B. cinerea %

根据药剂的不同浓度对灰葡萄孢生长的抑制率，回归获得了供试几种药剂对灰葡萄孢菌毒力回归方程（见表3），各药剂均能较好的拟合，抑制中浓度度分析表明了各药剂对葡萄灰霉菌的毒性，其大小依次为咯菌腈，苯甲·丙环唑，醚菌·啶酰菌，苯醚甲环唑，异菌脲，啶酰菌胺和嘧霉胺。因此，咯菌腈，苯甲·丙环唑作为无瓣海桑灰霉病防治的首选药剂。

表 3 供试药剂对灰葡萄孢的毒力回归方程及致死中浓度（EC50）Table 3 Virulence regression equations and lethal concentration of tested fungicides to B. cinerea

3 讨 论

灰霉病作为一种重要的植物病害，已倍受关注，多年来已研发了多种药剂用于田间防治，但随着用药时间和用药次数的增加，抗药性显来越来越突出。灰霉病对多种药剂产生的抗药性主要是因为灰霉病菌寄主范围广，繁殖快，遗传变异大，适合度高，易于产生抗药性[7-8]。常用内吸性杀菌剂大多为单作用位点，抗性风险较高，不合理用药造成较大抗药性选择压。研究表明灰霉病已对苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、N-苯基氨基甲酸酯类和苯胺基嘧啶类杀菌剂产生抗性，解决田间抗性治理问题需开展灰霉菌抗药菌株生物学及抗性机理的研究，为抗药性治理及抗性风险预测提供依据。

研究结果表明胳菌腈、醚菌·啶酰菌和苯甲·丙环唑对无瓣海桑灰霉菌具有较好的抑菌效果，咯菌腈是1995 年用作叶面喷施杀菌剂防治灰霉病等病害，主要干扰并破坏灰霉病菌的生物氧化和生物合成，抑制与葡萄糖磷酰化有关的转运，抑制菌丝生长，最终导致病菌死亡[9]另外2种为单剂的复配剂，通过2种不同作用机制对葡萄灰霉菌进行作用，可取得更好的防效，因此田间防治宜采用不同作用机制的复配物和不同药剂的交替使用，可有效防控（减缓）抗药性的产生，有利于灰霉病的综合治理。嘧霉胺属苯胺基嘧啶类杀菌剂，当前传统药物中防治黄瓜灰霉病、番茄灰霉病、枯萎病具有较高活性，通过抑制病菌浸染酶的产生从而阻止病菌的侵染并杀死病菌。 但在本研究中，嘧霉胺对灰葡萄菌的抑制效果不理想，在低浓度下（＜0.5 mg/L时）能刺激菌株的生长，其机理有待进一步研究。

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[3] 廖宝文,田广红,杨雄邦,等. 珠海淇澳岛无瓣海桑种苗天然更新与扩散分析[J]. 生态科学,2006,25(6):485-488.

[4] 李 云,郑德璋,郑松发,等. 红树林海桑苗灰霉病研究初报[J]. 森林病虫通讯,1996,(4):37-38.

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Isolating Botrytis cinerea from Sonneratia apetala and screening fungicides for controlling pathogen

XU Jin-zhu, QIN Chang-sheng, YANG Hua, ZHAO Dan-yang, JIE Yu-ze
(Guangdong Academy of Forestry Science, Guangzhou 510520, Guangdong, China)

Gray mold of S. apetala is one of key factors to decide the success or failure in the seedling culture. The seedlings with gray mold were collected from nursery and the pathogen, B. ceinerea was isolated and identif i ed in the lab. The toxicity of seven commercial fungicides were tested to B. ceinerea in the lab. The results show that Fludioxonil, Benzolyl Propiconazole and Kresoxim-methyl Boscalid had good inhibition effects with the EC50 0.10, 0.25 and 0.14 mg/L respectively, followed by Difernoconazole, Iprodiome with the EC50 2.28 and 6.44 mg/L, and Boscalid, Pyrimethanil had less bacteriostatic eff i cacy; Low concentration Pyrimethanil had a stimulating role on gray mold. The fi ndings provide a basis for fi eld-controlling B. cinerea of S. apetala.

Sonneratia apetala; Botrytis cinerea; fungicides screen

S763.1

A

1673-923X(2013)10-0015-04

2013-04-23

“十一五”林业科技支撑计划项目“红树林主要病虫害防控技术研究”（2009BADB2B0202）；广东省林业科技创新专项“生态景观林带主要树种病虫发生规律及防控技术研究”（2011KJCX027）

徐金柱（1978-），男，安徽来安人，高级工程师，博士，主要从事森林病虫害方面的研究

[本文编校：文凤鸣]