王 东,宋 君,叶先林,雷绍荣,刘文娟,常丽娟,尹 全,张富丽
(四川省农业科学院分析测试中心,四川成都610066)
从1993年国际上发布《测量不确定度表示指南》到2012年我国发布新版《测量不确定度评定与表示》(JJF1059.1—2012)超过10 a里,不确定度理论研究与评定实践在我国得到了长足发展[1-4]。相对于计量与校准实验室,不确定度评估在检测实验室的应用相对较少,主要原因可能在于检测实验室的检验报告涉及众多参数,测量不确定度的计算非常繁琐等[5]。
转基因成分定量检测是国际上主流的转基因检测方法,它通过测量指数时期扩增后的外源DNA数量,然后根据数学公式计算出样品中外源DNA的原始拷贝数量[6-9]。由于该技术操作步骤繁多、微量转移液体误差大、荧光基团易降解等原因,导致实验室之间检测结果差异较大。目前,我国尚未出台转基因生物及产品定量标识阈值[10-11],大多数转基因生物检测实验室没有开展测量不确定度评估工作。近年来,欧盟的转基因生物检测实验室摒弃了灵敏度不高的End Point PCR(终点多聚酶链式反应)方法,而用灵敏度较高的Quantitative real time PCR(实时定量多聚酶链式反应)检测转基因生物并评估其测量不确定度。国际上转基因生物测量不确定度评估,主要采用Top Down或Bottom Up[12]。
本研究采用Bottom Up途径,参考《测量不确定度评定与表示》(JJF1059.1—2012)[13],评估了样品中转基因大豆(GTS40-3-2)含量的不确定度,以期为转基因生物检测实验室不确定度评估提供参考。
本试验以含量为100%的转基因大豆(GTS40-3-2)粉末的DNA梯度稀释液作为制备工作曲线的DNA模板,以含量约为3%的GTS40-3-2混合粉末(转基因大豆GTS40-3-2粉末与非转基因大豆粉末按照质量比为3∶97的比例均匀混合)作为测试样品。
植物基因组DNA纯化试剂盒和real time PCR Master Mix试剂盒(均购自Tiangen生物技术有限公司(北京)),超微量分光光度计(Nanodrop1000,Thermo),高速冷冻离心机(Heraeus,Thermo),7500 Real Time PCR system(Applied Biosystem Incorporation,Foster city,USA)等。
称取100%含量的GTS40-3-2粉末和含量约为3%的GTS40-3-2粉末各100 mg,按植物基因组DNA纯化试剂盒(Tiangen生物技术有限公司,北京)说明书分离、纯化DNA。
根据《转基因产品检测核酸定量PCR检测方法(GB/T 19495.5—2004)》的附录A(转基因大豆实时荧光PCR方法)[14]中的引物、探针序列合成引物和探针。
将分离纯化得到的100%含量的GTS40-3-2粉末的DNA浓度,按照1∶5稀释成5个质量浓度梯度:100,20,4,0.8,0.16 ng/μL。将含量约为3%的GTS40-3-2粉末的DNA浓度稀释成50 ng/μL。取3μL上述DNA稀释液加入到25μL反应体系:2×Taqman Master mix 12.5μL,上下游引物(10μmol/L)各1μL,探针(10μmol/L)0.5μL,补水至25μL。每个DNA浓度稀释液做3个平行反应,待测样品做16个重复测试。在ABI7500型荧光定量PCR仪器上运行反应程序:95℃变性10 min;95℃15 s,60℃1 min,共40次循环。
根据实时PCR指数扩增期的循环数阈值(C t值)与基因含量对数值(lg A)之间的数学关系式C t=m×lg A+k(A 为内源基因(Lectin)或外源基因(GTS40-3-2)的质量;C t为仪器检测到的PCR反应循环数阈值;k为工作曲线在y轴的截距;m为工作曲线的斜率),以C t值为纵坐标,以lg A 值为横坐标,7500 Real Time PCR system仪器自带软件自动拟合工作曲线,得到内、外源基因含量的线性回归方程。
将所测样品外源基因或内源基因的C t值代入各自的回归方程,计算出样品中内源基因或外源基因的质量(或拷贝数)。再根据公式C=A外/A内×100%(C 为样品中转基因成分的百分含量(%);A外为样品中外源基因的质量;A内为样品中内源基因的质量),计算出样品中转基因成分的百分含量。
将GTS40-3-2含量约为3%的测试样品,进行16次重复测定,结果列于表1。
表1 测试样品中GTS40-3-2 含量测定结果
lectin内源基因和GTS40-3-2转化事件片段的工作曲线,由ABI7500 software 2.0软件自动拟合(表2,3)。lectin内源基因工作曲线的回归方程为y=-3.414x+31.604,相关系数R2=0.996;GTS40-3-2转化事件片段工作曲线的回归方程为y=-3.457x+29.732,相关系数R2=0.997。
表2 内源基因lectin 工作曲线拟合
表3 GTS40-3-2 工作曲线拟合
转基因生物测量的不确定度来源主要有探针标记荧光基团分解、仪器稳定性、基因扩增效率偏差等随机效应。此外,试验中微量液体转移、移液器定值偏差、内外源基因含量与荧光信号(C t值表示)的非线性偏离等都是基因定量分析结果的不确定度主要来源[15]。
2.4.1 A类标准不确定评定 A类不确定度由各类随机效应引起,按照Bessel公式计算:
式中,xi为GTS40-3-2每次相对含量测量结果值;x 为16次重复测量GTS40-3-2相对含量的平均值;n 为测量次数。
2.4.2 B类标准不确定评定
2.4.2.1 工作曲线读数C t值的不确定度 与lg A外对应的响应值C t外对GTS40-3-2工作曲线拟合的标准差,即回归标准差,按照以下公式计算:
在试样的测量次数p=16时,最小二乘法引入的不确定度分量为:
u(A外)=10lgA外×ln10×u(lg A);
u(A外)=A外×2.303×u(lg A)。
故其相对标准不确定度为:
urelA外=u(A外)/A外=2.303×0.010=0.023。
同理,与lg A内对应的响应值C t内对内源基因lectin工作曲线拟合的回归标准差为:
内源基因工作曲线的不确定度u(C t内)分量为:
u(A内)=10lgA内×ln10×u(lg A内);
u(A内)=A内×2.303×u(lg A内)。
故其相对标准不确定度为:
urelA内=u(A内)/A内=2.303×0.016=0.037。
按照统计原理计算得到工作曲线的不确定度,其自由度为n-2。故,νA外=n-2=15-2=13;νA内=n-2=15-2=13。
不同量程的移液器在加样过程中具有测量的独立性,因此,微量移液器允差带来的合成相对不确定度为:
2.4.2.3 B类标准不确定度的合成 B类不确定度各分量urel外,urel内,urel移液器彼此独立,其灵敏系数都为1,3个合成为B类标准不确定度为:
因为A类标准不确定度和B类标准不确定度彼此独立,故:
U=k×uc,包含因子k 为置信水准(P)95%,自由度νeff为198的t 分布临界值,按非整ν 内插计k为1.96,故U=1.96×0.002=0.016≈0.02。
所以,测量结果C=0.028±0.02。
测量不确定度是衡量实验室检测质量的重要尺度,一般来说不确定度越小,检测结果与约定真值越靠近,检测质量越高;但不确定度过小,在实验室间的数据比对时,往往造成比对数据离群[5]。被测量的不确定度取决于各输入量的不确定度,在评估测量结果的不确定度时,应先评定各分量的不确定度。本研究用Bessel公式估算16次重复测量GTS40-3-2含量结果的A类不确定度(uA=0.000 8)。由于转基因生物检测体系一般是微量体系(50μL以内),移液误差对检测结果影响较大;此外,数据对之间的非线性偏离会影响工作曲线的拟合。在B类不确定评估中,重点估算了内源基因(Lectin)、外源基因(GTS40-3-2)工作曲线的不确定度(urelA内=0.037,urelA外=0.023)以及反应体系(25μL)制备中微量液体转移的不确定度(urel移液器=0.07)。在此基础上,计算出合成了所有分量不确定度的合成不确定度(uC=0.002)。在95%的置信水平下(νeff=198,k=1.96),计算出扩展不确定度(U=0.02)。测量结果(C=0.028±0.02)接近约定真值(0.03),测量不确定相对较小,说明转基因大豆GTS40-3-2检测质量较高。
从各分量的不确定度看,微量液体转移引入的不确定度最大(0.07)。因此,在今后的测试中应重点注意微量液体转移量的准确性,尤其应重视移液器的校准。在实验操作中,应选用与移液器匹配较好、液体低吸附(low binding)的枪头,尽量降低移液器带来的不确定度。在转基因生物检测过程中,不同环节都可能产生不确定度[16],如送样种子颗粒数量与期望含量、样品缩分、DNA分离及其浓度测量、DNA溶液稀释、反应体系制备、荧光基团降解、工作曲线拟合等。本研究重点讨论了转基因生物检测中微量液体的转移和工作曲线引入的不确定度,是对转基因成分检测结果不确定度评定的初步尝试,而在实际测试中,应尽可能多地对从制样到数据分析等各个环节的不确定度进行评估,从而获得较准确的测量不确定度。
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