温度控制的PCR-CE微流控芯片的设计与制作

上海交通大学微纳米科学技术研究院微米/纳米加工技术重点实验室 姜 川 张卫平 骆 健 陈文元 吴校生 崔 峰

1.引言

微流控芯片的研究和发展已成为生物与医疗等领域的一个重点课题，因此设计一种能够完成某种实验的功能化芯片平台已成为科研人员关注的重点，性能良好的微流控芯片可以很好的解决实验中所遇到的难题，并且相对于其他大型设备，具有结构微小、使用便捷和制作费用较低等优势[1]。

基于上述微流控芯片的优势所在，利用微加工技术的特点，制作出一种集成式的PCR-CE芯片，主要目的是利用其作为PCR反应与CE分离检测的实验平台，较为方便与快捷的进行生物反应实验。

2.PCR-CE芯片的设计模型

我们设计的PCR-CE微流控芯片主要是要把分子的PCR反应与CE检测这两部分功能实现在同一块的芯片上，因为DNA的合成出的产物混在原料中，需要CE过程分离，并对产物进行检测，所以这两部分是一个连续的过程，相辅相成，因此将PCR与CE集成在同一块芯片上，提高了生物检测的效率。

本文设计的PCR-CE芯片为双层结构，基于玻璃材料具有热传导效果好、光学性能较好、表面改性容易、生物性能好、电渗效果优良等特性，以及聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS)具有获得高深宽比结构、生物性能较好、价格低廉和加工周期较短等特性[2]，采用PDMS-玻璃的复合芯片结构。其中PDMS材料可以作为PCR反应腔室和CE分离的制作材料；玻璃材料作为芯片的基底，同时两者的封装键合的工艺简单实用，且封装后效果较好，所以便于制作出PDMS-玻璃的结构芯片。

图1 设计的PCR-CE的PDMS玻璃结构的微流控芯片的整体图

图2 PDMS盖片的掩膜版

图3 电极层的掩膜版

图4 完整的PCR-CE芯片

图5 温度控制电路的实物图

图6 温度电阻关系图

图7 整体系统的组装图

我们设计的微流控芯片主要由反应液进口、混合通道、PCR反应腔室、CE分离通道以及电极组成，其中反应液进口、混合通道、PCR反应腔室、CE分离通道在上层结构中，由PDMS制成，下层为玻璃基底，并在玻璃表面溅射一层Cr/Pt电极，并将上下两层盖片键合在一起，组成了一个完整的PDMS-玻璃微流控芯片。如图1所示为设计的PCRCE的PDMS-玻璃微流控芯片的整体图。

3.加工与制备

加工制备芯片主要采用MEMS工艺，分别对芯片的上层PDMS盖片与下层Pt电极层进行微加工处理。下面主要讲解芯片的加工过程。

3.1 掩膜版的制作

设计图形的画制是利用AutocAD2009软件，制作过程对图形的宽度和相对位置要严格控制。掩膜版的材料选择为菲林版，这种版质加工速度快，容易得到，即采用分辨率较高的打印机用透明胶片对准打印剪裁便可得到，精度适合要求在线宽为30μm以上的图形结构，但是菲林版本身材质问题，光刻时需要粘在玻璃基板上使用，完全符合本芯片的要求。PDMS盖片加工采用负胶掩膜版，而Pt电极基板需要在玻璃基板上溅射一层Pt电极，因此采用正胶掩膜版制作。图2为PDMS盖片的掩膜版，图3为Pt电极层的掩膜版。

3.2 PDMS模具的制作

在制作PCR腔室和CE分离通道时，PDMS材料是不能直接进行微加工制作的，需要采用模塑法取得所需要的图形。即前期运用微加工技术在一块基底上加工出凸起的模型作为取膜工具，在模具上利用PDMS的固化过程取得微通道的图形，最后将复制的图形材料剥离开，便可以得到所需要的通道图形。

制备过程采用SU-8负胶显影得到，过程为：1)甩胶，采用溅射Cr/Cu的玻璃基底，用光刻机甩Su-8胶平铺整个基底，转速大约为2000R/min；2）前烘，将甩胶好的基板先防治60℃的恒温箱内10min，再放入90℃环境中50min，目的是提高胶体与基底金属的结合力；3）曝光，利用PDMS盖片的掩膜版在曝光机下进行2min的曝光；4）显影，先在粗显影液中将后烘好的基板上下移动，大约1min后，再在精显液中上下移动，大约30s；5）后烘，显影好的基板放入180℃烘箱内约3h后，取出便可以使用。

3.3 制作上层PDMS盖片

PDMS未使用前由两部分组成，为树脂和固化剂，两种物质均为液态。当使用时，树脂与固化剂按10：1的比例混合。制作所需的PDMS上层盖片时，将已经配好的PDMS混合物质浇注到已经制作好的负胶图形的模具上，并放置在一定高度的容器或者其他环境上，因为需要控制浇注的高度，如果直接浇注则流体会流出盖片范围。大约浇注的厚度为5mm-7mm左右，这样便于在盖面的出口处键合管道入口管和防止外界空气进入盖片内部，而过厚的话将会引起固化过程出现形变严重，无法取到图形。待浇注完毕后，放置于真空泵中进行抽气，30min后取出，将之放置60℃的烘箱内进行固化处理，大约放置4个小时固化完全取出进行脱模处理[3]。

3.4 Pt电极层的制备

下层基板选用3.3英寸、1mm厚的玻璃基底，并在玻璃基底上加工一层铂电极[4]，具体过程如下：1)将上一步清洗干净的玻璃基底取出，用溅射机溅射一层3000A的厚的Pt金属层；2)将一溅射好的铂金属层的玻璃基板甩上正胶，根据所需电极的线宽不同，正胶的厚度大约为5-6um，如果线宽变大则甩胶的厚度也会相应提高；3)将甩好胶的基片用光刻机进行光刻处理，取出后立即进行显影过程，其中粗显大约1min左右，精显30s左右，同样需要用镊子夹住基板，在显影液中上下移动；4)将显影好的片子用专用的溅射刻蚀机进行等离子体照射击打，这样便能将未能用正胶覆盖部分的牺牲层去除；5)最后为了得到图形化的金属层，用丙酮和酒精去除覆盖在基片表面的正胶，即可得到最终图形化的Pt电极，作为下层基板使用。

3.5 PDMS盖片与Pt电极层的键合

在已图形化的Pt电极上甩一层很薄的PDMS，然后迅速放置甩胶机上，调至3000r/s的速度约1min左右[5]，这样便能得到一层很薄的PDMS层，同时放置60℃的烘箱内固化；同时将上层PDMS盖片放置等离子去胶机内照射约1min左右取出，这时将下层电极基板从烘箱取出，这时候由于PDMS的固化作用，处于基本固化形成，但是仍有粘性的状态，这样在键合时便更能增加两者的结合力和提高封装的稳定性。键合过程要注意对准环节，因为上下两层图形都有对准符号，只要把对准符号找准键合即可。待键合完毕后，需要使PDMS薄层完全固化，所以需要再次将封装好的芯片放置60℃烘箱内。

此时一个完整的PDMS-玻璃的PCR-CE芯片便制作成功，可以进行后续的加热和温度检测使用，并为PCR扩增提供一个完整的实验平台。图4为已制备加工成的PCR-CE芯片的成品。

4.PCR-CE芯片的温度控制电路设计

PCR的合成过程最核心的就是温度控制，即在变性、退火、延伸这三个过程依次稳定在90℃、60℃、72℃附近的区域，并且可以循环控制[6]，所以这是PCR-CE芯片的外围控制电路的设计核心，也是我们设计温度控制电路的目的所在。

我们所设计的控制系统有三个部分组成，这其中包括硬件控制系统、优良的控制算法和良好的人机界面平台。设计核心就是利用芯片的Pt金属具有温度-电阻特性，即电阻随着温度的变化呈线性变化规律，这样利用相应的电路系统将Pt的实时电阻电阻值测出，并转化为电压信号，再利用输入到计算机软件中进行运算，根据运算结果实时转化为温度值与设定温度值进行比对，高于设定温度值则利用散热片与风扇的双重降温机制对PCR-CE芯片降温；而低于设定的温度值则会输出升温信号给Pt电阻，利用电路对Pt电阻进行升温控制[5]。

温控系统的硬件系统主要包括了PC平台、恒流源模块、信号放大输出模块、风扇散热片降温模块、电路加热模块和温度感应模块。

恒流源模块即利用SX3002的5V恒压源与HA5221高精度运算放大器组成一个恒流源，即运算放大器的一个输入端加5V电压，另一个输入端加2kΩ的电阻，这样便会输出为2，5mA的电流，再将恒流源电路接入到Pt电极上，随着Pt的温度变化，阻值会发生线性变化，进而会在电路上输出线性电压信号。

由于软件系统的测量与运算需要在一定范围与精度内工作，因此硬件系统的电压值也需要在一定范围内测量，所以要设计信号放大模块，信号放大模块的芯片采用AD812高精度电流反馈放大器，AD620的放大倍数计算公式为A=1+49.4kΩ/R，根据电阻的规格，我们选用5K阻值的电阻，这样根据计算放大倍数为10.9倍，这样给软件系统的输出电压值在3.27V左右变化，测量的精度提高到0.035℃的温度检测最小指标，温度变化幅度为0.1℃以下，达到精确控制的要求。

加热模块是当Pt实测温度值低于预设温度值时开始工作，软件系统便会发出信号驱动加热模块工作，使芯片能够迅速加热到预设温度，加热电路采用OPA603高电流运算放大器为核心芯片，将芯片与Pt加热电极与软件输出接口OA0连接，当PCR腔室需要升温的时候，软件系统便会控制加热电路通过Pt加热电极对PCR腔室升温，加热模块可以提供200mA电流，便可以迅速升高Pt电极温度。

降温模块是当Pt实测温度值高于预设温度值时开始工作，软件系统通过输出接口OA1与另外一个OPA603连接，OPA603利用继电器控制降温装置工作，由于风扇不能达到迅速降温的目的，因此需要将风扇上放置制冷片进行双层制冷。当需要降温时，OPA603控制继电器衔铁吸合，进而风扇与制冷片电路导通工作，降低芯片的温度到预设温度。

将这几个模块搭建在一起变组成了PCR-CE芯片的温度控制电路，图5为温度控制电路搭建的实物图。

5.PCR-CE芯片的软件控制平台

软件系统首先要通过温度传感电极收集Pt的电压数据，根据在软件系统内处理过的电压-温度曲线计算出实时温度，再对比实时温度与设定温度之间的大小，进而利用软件系统去控制硬件系统的加热单元或者降温单元对芯片进行加热或者降温处理，这是编写软件程序的最初思路。对于实验人员来说不需要了解软件系统如何去工作，而是要提供给工作人员一个简单快捷方便的界面，通过了解界面所给出的曲线和物理量的数据进而调节数据达到控制PCR反应温度的目的。

软件控制平台的搭建我们采用Labview人机开发系统，将Labview软件平台搭建在PC上，并用PIC总线与采集卡和PC进行通信，数据采集卡对硬件电路的电压信号进行实时采集，并通过PIC总线传送给PC的Labview系统，Labview系统的软件通过采集的电压信号进行实时处理。

其中软件系统主要包括温度电压换算程序、预设温度程序、PID调节控制程序等程序。

温度电压换算程序依据Pt电极的温度感应特性，即存在着温度与电阻的一种线性关系。这样我们通过外围的控制程序进而得到在每温度变化0.1℃时对应的电阻值，在60-100℃区间内测量约为400组数据，这样利用orgin8.0软件采用最小二乘法，得到温度与电阻的线性曲线，又因为我们采用恒流源，进而得到温度与电压之间的线性关系，为后续的控制提供了运算工具。图6为拟合好的Pt电极的温度电阻关系图。

预设温度程序是一个对比的标准，实验中需要得到实时温度值与预设温度值进行对比，从而达到控制的目的。PCR反应需要在变性温度为90℃，退火温度为60 ℃，延伸温度为72℃这三个温度区内进行[7]，因此先预设这三个温度点以及该温度所需要持续的时间，再通过硬件系统以及外围控制程序得到芯片的实际温度，预设温度在一个时间点确定它的时间范围，实时温度再与该时间点的预设温度进行比较，便会得到需要加热或者降温的信号处理，利用后续的PID控制程序进行外围的硬件系统的加热或者降温处理。

PID控制程序的主要目的是将实时温度迅速提高或者降低为预设温度，从而提高PCR合成的效率，因此PID控制程序是软件系统的核心，也是整个PCR反应的温度控制的核心。本实验的输出公式为[8]

根据PID控制原则，比例环节中的误差值e为实时温度与设定温度之间的差值，微分环节的e1为本次的实时温度与设定温度的差值与上一次的实时温度与设定温度的差值之间的差值，积分环节的e2位以前所有的误差值得综合，这样便能组成这样的输出公式。根据PID运算便能迅速的进行加热与降温工作[9]。

6.整体系统的搭建与检测

待PCR-CE芯片、温度控制电路系统与软件系统研制成后，进行系统组装，图7为组装完成的系统图。

通过实验证明，芯片的PDMS盖片与Pt电极层键合性能良好，没有出现液体侧漏的情况，系统的温度控制如预期一样可以完成温度控制，并且升温速度可达到12℃/s，降温速度可以达到5℃/s，完全达到PCR-CE实验的性能指标。

7.结论

本文主要介绍了温度控制的PCR-CE芯片的制作工艺、温度控制电路的搭建以及软件平台的设计，完成了一个完整的PCR-CE温度控制系统的建立，为后期进行PCR实验与CE实验提供了实验平台。同时系统还存在着一些不足的地方，即存在系统的集成化有待于提高，降温的速度相对于升温速度明显偏低和芯片的生物亲和性低等问题。

[1]陈文元,张卫平.集成式微流控聚合物PCR芯片[M].上海:上海交通大学出版社,2009.

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[4]Xia Y N,Whiteside G M.Soft Lithography.Annual Review of Materials Research,1998,28:84-153.

[5]Duffy,D.C.;McDonald,J.C.;Schueller,O.J.A.;Whitesides,G.M.;Anal.Chem.,Rapid Prototyping of Micro fl uidic Systems in Poly(dimethylsiloxane),1998,70,4974-4984.

[6]Lao AIK,Lee TMH,et al.Precise temperature control of micro fl uidic chamber for gas and liqiud phase reactions[J].Sensors and Actuators.2000,84:11-17.

[7]Mamdani E H.Application of fuzzy algorithms for control of simple dynamic plant[J].Proc.Inst Elect-Eng,1974.D-121:1585-1589.

[8]Dae-Sik Lee,Se Ho Park,Kwang Hyo Chung,and Hycon-Bong PYO,A Disposable Plastic-Sicon Micro PCR Chip Using Flexible Printed Circuit Board Protocols and ITS Application to Genomic DNA Amplification[J].IEEE Sensors Journal 2008,8(5):557-564.

[9]江伟,袁芳.Labview环境下温度控制系统的设计[J].国外电子测量技术,2004(3):8-10.