应用分子标记检测作物杂交种纯度研究现状及比较分析

刘子记，曹振木，杨衍

（中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业部华南作物基因资源与种质创制重点开放实验室，海南儋州，571737）

种子是重要的农业生产资料，是实现农业科技进步的载体。种子质量的优劣直接影响农产品质量和优良品种的增产潜力，而种子质量的好坏在很大程度上取决于种子的纯度，开展种子纯度检测对保证种子质量和提高生产效益具有重要意义。生物混杂及机械混杂是影响杂交种纯度的主要原因，作物杂交种纯度检验的常用方法主要包括形态鉴定、田间鉴定和同工酶电泳技术鉴定等[1]。种子形态差异有限，且易受环境条件影响，因此形态鉴定准确性较差；田间鉴定所需时间较长，成本较高，表型易受栽培措施和环境条件的影响，不同的鉴定者对同一性状的评价也存在一定的差异，不能满足快速检测杂交种纯度的需要；同工酶鉴定虽然准确、可靠、不受外界环境影响，但多态性不够丰富，且有组织和器官特异性[2]。

随着作物新品种数量的不断增加，遗传基础日趋狭窄，传统的鉴定方法不能有效区分遗传关系较近的杂交种[3]，难以满足作物杂交种纯度鉴定在精确度方面的要求。近年来，随着DNA分子标记技术的问世及迅速发展，使得从基因组水平上检测杂交种纯度成为可能。分子标记技术能够从DNA水平上揭示杂交子代与亲本间的遗传差异，不受植株生长季节的限制，不受基因表达、栽培条件和环境条件的影响，无器官、组织及发育特异性，能够检测微小的变异，多态性丰富，稳定性高，可以大大缩短检验时间[4]。近年来，分子标记技术在国内外被广泛应用于作物杂交种纯度鉴定。

1 RFLP分子标记在鉴定作物杂交种纯度中的应用

RFLP （Restriction fragment length polymorphism）分子标记，即限制性片段长度多态性，其基本原理是利用限制性内切酶酶切基因组DNA，酶切后的DNA分子经凝胶电泳、转膜和变性，利用放射性同位素标记的探针与膜上的DNA片段杂交，检测由碱基的插入、缺失、重排或点突变引起的多态性，是发展最早的DNA标记技术。

RFLP标记具有稳定可靠、结果准确、不受植物发育阶段影响等优点。Smith等[5]利用RFLP分子标记成功鉴定了78个玉米杂交种品种；Matsuura等[6]研究结果表明，利用RFLP标记可快速检测黄瓜杂交种的纯度（表1）。但由于RFLP标记操作程序繁琐、成本较高、多态性检出率低、对DNA的需求量大且质量要求较高、并且放射性同位素对操作人员身体有害，此法不适于进行大批量杂交种纯度鉴定，在实际应用中受到限制。

2 RAPD分子标记在鉴定作物杂交种纯度中的应用

RAPD（Random amplified polymorphic DNA）标记，即随机扩增多态性DNA，该技术建立在PCR基础上，以基因组DNA为模板，以10个碱基左右的随机寡聚核苷酸序列为引物，检测遗传位点的多态性，可对未知序列的基因组进行多态性分析。该技术具有操作简便、成本低、自动化程度高、分辨率高、实验周期短、灵敏度强、检测位点多、DNA用量少等优点，能有效检测从形态和生化指标上均无法检测到的差异，被广泛用于杂交种纯度鉴定、基因定位和基因克隆等多方面研究。RAPD标记被成功应用于苦瓜[7]、冬瓜[8]、南瓜[9]和西瓜[10]等瓜类作物杂交种纯度的鉴定；莫结胜等[11]利用RAPD标记鉴定杂交油葵种子纯度，鉴定结果与大田检测结果基本一致；朱海山等[12]和葛菊芬等[13]研究结果表明，RAPD标记可以用于番茄和辣椒等茄果类作物杂交种纯度的鉴定；邵景侠等[14]成功利用RAPD标记对杂交小麦西杂一号进行纯度鉴定（表1）。

由于RAPD标记属于显性标记，不能有效区分纯合基因型和杂合基因型，另外其稳定性和重复性较差，易受各种因素的影响，通常将其转化为SCAR（Sequenced characterized amplified regions）标记，其原理是将多态性片段回收、克隆、测序后，设计出较长的引物进行特异扩增，可以显著提高检测的稳定性和实用性。陈灵芝等[15]成功将RAPD标记转化成SCAR标记，有效地将陇椒5号辣椒杂交种与母本区分开来；王飞等[16]建立了检测金棚1号番茄杂交种纯度的SCAR标记技术体系，为金棚1号番茄种子的生产与销售提供了有效的检测方法（表1）。

3 AFLP分子标记在鉴定作物杂交种纯度中的应用

AFLP（Amplified fragment length polymorphism）分子标记，即扩增片段长度多态性，该技术利用限制性内切酶酶切基因组DNA，将特定的接头与酶切后的DNA片段连接，根据接头与酶切位点的序列设计PCR引物进行扩增，检测遗传位点多态性。

该技术具有多态性丰富、重复性高、可靠性好、不需要预先知道基因组序列信息等优点。刘杰等[17]试验结果证明，利用AFLP标记检测向日葵杂交种纯度是可行的；宋顺华等[18]成功利用AFLP技术将90个大白菜品种区分开来；王玲平等[19]以瓠瓜杂交种浙蒲2号及其父、母本为材料，成功建立了利用AFLP分子标记进行瓠瓜杂交种纯度鉴定的技术体系（表1）。但由于操作繁琐、对试验技能要求较高，试验周期较长，对DNA的质量要求很高，AFLP技术难以在种子纯度鉴定中获得广泛应用。

4 SSR分子标记在鉴定作物杂交种纯度中的应用

SSR（Simple sequence repeats）标记，即简单序列重复，是一类由几个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，SSR两侧的序列一般相对保守，通过设计特异引物进行扩增，根据串联重复单位数目的差异检测多态性。

SSR标记具有数量丰富、在染色体上分布均匀、多态性高、共显性遗传、等位性变异丰富、重复性好、对DNA质量要求不高且需要量少、操作简单、不受环境因素影响等优点，已在多种农作物杂交种纯度鉴定中得到应用。兰刚等[2]、王爱娜等[20]和宋贤勇等[21]分别利用SSR标记对油菜杂交种合油杂2号、秦优33和秦优11进行纯度鉴定，鉴定结果与田间鉴定结果基本一致；高海娜等[22]和苗明军等[23]成功利用SSR标记对甘蓝杂交种秦甘50和西园4号进行纯度鉴定；管志坤等[24]利用SSR标记鉴定油绿3号大白菜品种纯度，鉴定结果与田间鉴定结果非常接近；SSR 标记广泛用于西瓜[25]、黄瓜[26，27]、瓠瓜[28]、甜瓜[29，30]杂交种纯度鉴定，初步建立了利用SSR分子标记鉴定瓜类作物杂交种纯度的技术体系；大量研究表明，SSR标记可应用于玉米杂交种郑单 958[31]、黔单 16[32]、宁单 11[33]纯度鉴定，与田间鉴定相比，准确性更高，速度更快，能大大提高检测效率；王利英等[34]和白占兵等[35]研究结果表明，利用SSR分子标记检测茄科作物茄子和辣椒杂交种纯度可行且高效，具有一定的理论和应用价值；陈志伟等[36]研究结果证明，利用SSR分子标记可以快速、有效地鉴定大麦杂交种纯度；田蕾等[37]利用多对SSR标记鉴定大豆杂交种纯度，检测结果完全一致；赵振卿等[38]利用SSR标记对花椰菜杂交种浙801纯度进行鉴定，鉴定结果与田间鉴定结果一致（表1）。

开发基因组SSR标记成本较高、步骤繁琐、费时费力。EST-SSR （expressed sequence tag-simple sequence repeat）标记是根据EST序列中的简单串联重复序列开发的一种标记类型，具有SSR标记和EST技术的优点，并且降低了开发成本、节省了开发时间、提高了开发效率，另外，EST序列高度的保守性使得EST-SSR标记在种与品种间有较好的通

用性，显著提高了其利用价值。近年来，随着基因组测序的发展，丰富的EST序列资源为EST-SSR标记的开发提供了有利途径。卢锐等[39]筛选出2对EST-SSR标记，可用于黄瓜杂交种纯度的鉴定；张庶等[40]研究结果表明，EST-SSR标记可以快速、准确地鉴别大白菜杂交种纯度；张国裕等[41]利用ESTSSR标记对南瓜属作物杂交种进行纯度检测，与田间鉴定结果相符；匡猛等[42]试验结果证明，利用EST-SSR标记鉴定棉花杂交种纯度与田间鉴定结果的相关性显著高于基因组SSR标记；赵新等[43]筛选得到1对共显性的EST-SSR标记，可用于花椰菜杂交种纯度的鉴定，鉴定结果与田间形态鉴定结果较为一致。

表1 分子标记技术在作物杂交种纯度鉴定中的应用

5 SRAP分子标记在鉴定作物杂交种纯度中的应用

SRAP （Sequence-related amplified polymorphism）标记，即相关序列扩增多态性，该技术通过独特的引物设计对基因的开放阅读框区域进行扩增，上游引物与外显子区域特异结合，下游引物与启动子或内含子区域结合，检测不同个体间内含子、启动子及间隔区序列长度不同产生的多态性。

该标记技术具有操作简单、高共显性、稳定性强、分辨率较高、重复性好、成本低、在基因组中分布均匀等特点，在作物杂交种纯度鉴定中有着广泛的应用。扈新民等[44]利用SRAP分子标记对辣椒杂交种航椒4号进行纯度检测，与田间鉴定结果十分接近。钟开勤等[45]研究结果证明，SRAP标记可以用于花椰菜杂交种纯度鉴定；张永平等[46]和熊丽曼等[47]成功利用SRAP标记对甜瓜杂交种进行纯度检测；黄建都等[48]研究结果表明，SRAP标记技术可用于甘蓝杂交种夏华2号纯度鉴定，鉴定结果与田间鉴定结果一致；盖树鹏等[49]试验结果证明，与SSR标记相比，利用SRAP标记检测杂交种纯度更接近田间鉴定结果（表1）。

6 SNP和InDel分子标记在鉴定作物杂交种纯度中的应用

随着作物基因组测序工作的进展，新型分子标记 InDel （Insertion-deletion） 和 SNP （Single nucleotide polymorphism）的开发越来越容易，为利用新型分子标记进行作物杂交种纯度鉴定创造了有利条件。InDel标记，即插入缺失标记，指由核苷酸水平上碱基的插入或缺失引起的多态性。SNP标记，即单核苷酸多态性，指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。

InDel和SNP标记具有数量丰富、稳定性好、高通量和高度自动化等优点。兰青阔等[50]利用InDel标记检测黄瓜津优38杂交种纯度，与SSR标记鉴定结果基本一致；张体付等[1]成功利用InDel标记对6个玉米杂交种进行了纯度鉴定；兰青阔等[51]基于SNP标记检测黄瓜杂交种优一种子纯度，鉴定结果与SSR标记鉴定结果相符。

7 展望

随着生物技术的不断发展，作物杂交种纯度鉴定技术也由主要依赖田间鉴定进入分子鉴定水平，分子标记技术因其快速、准确、稳定、节省大量人力和财力以及不受环境因素影响等特点，逐步成为作物杂交种纯度检测的首选工具，为杂交种纯度鉴定提供了一种更为有效和可靠的方法[52]。不同的分子标记技术具有不同的优缺点，在实际应用中，要根据研究对象充分发挥标记技术优势，这样才能更准确、快速地达到鉴定目的。

在作物杂交种制种过程中，由于隔离不严导致的生物混杂是不可避免的现象，因此，利用单对标记鉴定杂交种纯度具有一定的局限性。为确保鉴定结果的准确性和可靠性，应同时对供试样品的多个遗传位点进行检测分析。选取位于染色体不同区域的标记组合起来进行检测，不仅可以区分亲本自交种，还能有效检测出其他来源花粉所导致的生物性混杂。

分子生物学技术的飞速发展将会导致新的分子标记不断出现，现有的技术也会不断得到完善。将分子标记技术与传统育种方法相结合，可快速、准确地对杂交种纯度进行早期检测，对于保证种子质量和优良品种推广具有重要意义。

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