鼎湖鳞伞多糖的提取工艺及体内免疫调节活性的研究

李作美，柯春林，曾晓雄

(1.蚌埠学院生物与食品工程系，安徽蚌埠233000;2.南京农业大学食品科技学院，江苏南京210095)

鼎湖鳞伞(Pholiota dinghuensis Bi)是一种大型真菌，位于广东鼎湖山庆云寺附近，生境在阔叶林中凸脉榕和韶子活树干上或基部群生、簇生［1］。该种为中国特有种［2］。食药用真菌作为药物在我国已经具有悠久的历史，早在两千多年前的东汉末期，世界上第一部药物专著《神农本草经》中就记载了灵芝、茯苓、猪苓等真菌的药用功效［3］。明代著名的医药学家李时珍编著的《本草纲目》，载药1892种，据不完全统计，其中有药用真菌40余种，如香菇、马勃、猪苓、茯苓、木耳等，并进行了简单的分类，将真菌药材大部分收载于菜部卷中，说明他那时就已注意到有些药用真菌同时具有食用价值［3－4］。经大量研究表明，绝大多数真菌多糖都具有免疫调节作用［5－7］。如银耳多糖、灵芝多糖、香菇多糖等的免疫调节活性比较明显。新疆阿魏菇能有效增强小鼠的体液免疫功能，且有剂量依赖关系［8］。茯苓多糖在临床上不仅是一种较好的免疫增强剂，而且能抗胸腺萎缩，减少脾脏增大，对免疫器官有很好的保护作用［9］。目前国内外有关鼎湖鳞伞的研究报告很少。本文对鼎湖鳞伞多糖(polysaccharide from Pholiota dinghuensis Bi，PFPD)的免疫调节活性进行了研究，旨在为今后研发出新的天然药物或保健品等方面，提供一定的实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鼎湖鳞伞粗多糖 南京农业大学食品科技学院酶工程实验室制备;雌性昆明种小白鼠 中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心(北京);小鼠用实验动物饲料 江苏协同生物工程有限公司;绵羊全血及豚鼠血清 上海川翔生物科技有限公司;无水乙醇、丙酮 均为分析纯试剂;纯净水 购于苏果超市;环磷酰胺 江苏恒瑞制药有限公司;溶菌酶(LZM) 南京建成生物工程研究所;二硝基氟苯 江苏恒瑞制药有限公司;盐酸左旋米唑购于济南奥德凯药业有限公司;RPMI1640培养基 上海生工生物工程有限公司。

HH－4型数显恒温水浴锅 江苏国华电器有限公司;HY－08高速粉碎机、DHG－9030A型电热鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司;Heidolph Laborota 4000真空旋转蒸发仪 德国Heidolph;AY－120电子精密天平、BL－220H分析天平 日本Shimadzu;Anke TDL－5低速离心机 上海安亭科学仪器厂;HYQ－2121A型旋涡混匀器 苏州捷美电子有限公司;Synergy－2型酶标仪 美国Biotek公司;0101型打孔机 宁波得力集团公司。

1.2 实验方法

1.2.1 水提醇沉法制备粗多糖 取10g样品粉末置于烧瓶内，在90℃的热水中，按照液料比20mL/g浸提6h，过滤后合并滤液，浓缩至原体积的1/5加入3倍体积的95%的乙醇纯沉24h，以1000r/min的离心10min，分别以无水乙醇、丙酮冲洗2～3次，得到PFPD。

多糖得率(%)=鼎湖鳞伞多糖质量/供试样品质量×100

1.2.2 PFPD提取的单因素实验 提取温度的影响:分别称取5份1g鼎湖鳞伞菌丝体粉末，在浸提时间为 6h，液料比为 20mL/g，分别以 60、70、80、90、100℃五个温度进行实验，考察提取温度对PFPD得率的影响。提取时间的影响:分别称取5份1g鼎湖鳞伞菌丝体粉末，在浸提温度为90℃，液料比20mL/g，以浸提时间为2、3、4、5、6h 五个时间梯度进行实验，考察提取时间对PFPD得率的影响。提取液料比的影响:分别称取5份1g鼎湖鳞伞菌丝体粉末，在浸提时间为6h，浸提温度为 90℃，以液料比为 5、10、15、20、25mL/g五个梯度进行实验，考察液料比对PFPD得率的影响。

1.2.3 鼎湖鳞伞多糖提取工艺正交实验 选取浸提温度(℃)、浸提时间(h)和液料比(mL/g)这三个因素进行三水平的正交实验，因素水平表见表1。

表1 各因素水平设计Table 1 Design of every factor and level

1.2.4 动物分组及实验设计 鼎湖鳞伞多糖体内免疫调节活性研究参照柯春林等［10－15］报道的方法作了一些修改。取同批次6周龄健康的雌性小白鼠，体重为(20±2)g进行适应性饲养。饲养8d后，选择体质健壮、体重相近的小白鼠进行分组实验。每组8只，共设置6组:第1组为正常对照组;第2组为模型对照组;第3组为阳性对照组;第4组为鼎湖鳞伞多糖低剂量组，标记为PFPD－50;第5组为鼎湖鳞伞多糖中剂量组，标记为PFPD－100;第6组为鼎湖鳞伞多糖高剂量组，标记为 PFPD－200。正常对照组(Normal)每天腹腔注射一次生理盐水0.5mL，共注射8d;环磷酰胺模型组(Cy－Model)每天腹腔注射一次生理盐水 0.5mL，共注射 8d;实验的第 2、3、4d，在每次注射完生理盐水10h后，按剂量100mg/kg BW腹腔注射环磷酰胺一次;阳性对照组(Positive):每天腹腔注射一次盐酸左旋米唑7mg/kg，共8d。鼎湖鳞伞多糖(PFPD)低剂量组每天一次腹腔注射多糖样品剂量为50mg/kg BW;鼎湖鳞伞多糖(PFPD)中剂量组每天一次腹腔注射多糖样品剂量为100mg/kg BW;鼎湖鳞伞多糖(PFPD)高剂量组每天注射剂量为200mg/kg BW的多糖样品一次。实验的第2、3、4d，在注射完多糖样品10h后，按计量100mg/kg BW腹腔注射环磷酰胺一次。实验连续进行8d，末次给药12h后，将所有小鼠采用脱颈椎法全部处死，眼眶取血。解剖取出胸腺、脾脏，称重并计算脾指数，胸腺指数，耳肿胀度，同时并测定血清溶血素及血清和脾脏中溶菌酶活性。小鼠饲养期间的环境温度大约在24℃。实验期间小鼠定量摄食(250g/kg BW左右)、自由饮水，鼠笼每天更换一次垫料。

1.2.5 鼎湖鳞伞多糖对免疫抑制小鼠器官的影响在末次给药12h后，解剖小鼠取出脾脏、胸腺，用生理盐水洗去血渍，滤纸吸干，称重，计算脏器指数。

脏器指数(mg/g)=W1/W0

综合以上分析，本文发现，中美英三方在实现不同的话语目的而采取了不同的趋近化语言策略，分别如图1、图2和图3所示。

式中:W0为小鼠体重(g)，W1为脏器重量(mg)。

1.2.6 鼎湖鳞伞多糖样品对小鼠迟发型超敏反应的影响 注射给药的第3d，给小鼠腹部剪去小块毛发，面积约3cm×3cm，用1%二硝基氟苯(DNFB)50μL涂擦去毛部位。注射给药的第7d，用1%二硝基氟苯20μL涂擦小鼠右耳两侧，左耳不擦作对照用。在末次给药12h后，将小鼠脱颈椎处死后，用直径为6mm的打孔器将左右耳片分别打孔，计算耳肿胀度。

耳肿胀度(%)=(W1－W0)/W0×100

式中:W0为左耳重量，W1为右耳重量。

1.2.7 鼎湖鳞伞多糖样品对小鼠血清溶血素的影响(HC50) 在各组小鼠给药的第4d，腹腔注射绵羊红细胞0.2mL致敏。将制备好的血清稀释至适宜倍数，各取0.2mL稀释血清和2%的绵羊红细胞0.1mL，再加入0.2mL配制好的豚鼠血清，混匀后放入37℃水浴30min。然后从每个样品中吸取150μL加到酶标板中，且每个样品均做3个重复，用酶标仪测540nm处的吸光度(OD540nm)值，记录每个样品的吸光度值，以OD值作为判定血清溶血素的指标，比较各处理组小鼠的差异。空白对照:是用生理盐水0.2mL代替血清样品，其他操作同上。

1.2.8 鼎湖鳞伞多糖样品对小鼠脾脏和血清中溶菌酶的影响 按上述方法，去脾脏，并且取出后将脾脏置于冰上，与生理盐水按重量/体积比1∶9制备10%组织匀浆，5000r/min离心取上清液，放于－20℃冰箱冷冻保存备用。断头处死小鼠后，解剖取出胸腺脾脏，同时称重并计算脏器指数(mg/g BW)。用商业试剂盒测量(按其说明书操作)各组血清中溶菌酶(LZM)的含量。血清中LZM含量的测定是基于溶菌酶能够水解细菌细胞壁上粘多糖而使细菌裂解、浓度降低、透光度增强的比浊法，表示为μg/mL。分组实验连续饲养8d，最后一次用药后便停食。24h后，称重小鼠后断头处死，立即收集血液于小离心管中。血液样品静置1h，4000r/min离心10min制备小鼠血清。以上操作均在冰上进行，血清置－20℃冰箱冷冻保存备用。

1.2.9 统计分析 实验结果数据表示为平均值±标准差(SD)，并应用单因素方差分析和Duncan氏多重比较进行差异显著性分析。p＜0.05被认为差异是显著的。所有数据的分析比较都运用SPSS18.0版本进行。

2 结果与分析

2.1 鼎湖鳞伞粗多糖提取条件的单因素实验

2.1.1 提取温度对多糖得率的影响 由图1可知，当提取温度在60～90℃范围内，随着热水浸提温度的升高，多糖含量呈现逐渐增加趋势，并且增加趋势明显。当提取温度为90～100℃时，多糖含量随着温度的升高，增加趋势不明显。由于浸提的温度太高，多糖的结构会发生变化，所以确定提取的温度为90℃。

图1 提取温度对多糖得率的影响Fig.1 Effect of temperature on extraction rate of polysaccharides

2.1.2 提取时间对多糖得率的影响 从图2中可以看出，在2～6h之间，随着浸提时间的延长，多糖提取的含量逐渐增加。当浸提的时间为6h时，提取的多糖含量最多，至6h后再延长提取时间，提取的多糖含量逐渐下降。因此，以提取的时间为6h为宜。

图2 提取时间对多糖得率的影响Fig.2 Effect of time on extraction rate of polysaccharides

2.1.3 液料比对多糖得率的影响 由图3可知，在液料比为5～20mL/g范围内，随着液体比例的增加，提取的多糖含量随之增加，但在20～25mL/g范围内，随着液体比例的增加，提取的多糖含量有所减少，因此采用提取的液料比为20mL/g。

图3 液料比对多糖得率的影响Fig.3 Effect of solvent－to－solid ratio on extraction rate of polysaccharides

2.2 鼎湖鳞伞多糖提取条件正交实验

以影响鼎湖鳞伞多糖得率的提取温度(℃)、提取时间(h)和液料比(mL/g)这三个因素进行L9(33)正交实验，考察这三个因素的协同作用下多糖的得率。其结果如表2。

表2 正交实验结果Table 2 The result of orthogonal experiment

由表2可知，对鼎湖鳞伞胞内多糖得率的影响因素依次为RB＞RC＞RA，最优化组合为 A2B3C2，即PFPD提取条件确定为液料比20mL/g、提取时间为6h、提取温度90℃，此条件下多糖的得率为8.95%。通过水提醇沉法得到的粗多糖，主要成分为多糖类物质还有蛋白质及少量的小分子物质［16］。

2.3 鼎湖鳞伞多糖对小鼠免疫器官脏器指数的调节作用

由于胸腺和脾脏是动物的重要免疫器官，因此胸腺指数和脾脏指数的大小可以直接反映出机体免疫功能的强弱［17］。表3是鼎湖鳞伞多糖对小鼠免疫器官胸腺和脾脏的影响。

从表3中可以看出，PFPD－50为鼎湖鳞伞多糖低剂量组;PFPD－100为鼎湖鳞伞多糖中剂量组;PFPD－200为鼎湖鳞伞多糖高剂量组。模型组与正常对照组相比，脾脏指数和胸腺指数均显著减少。鼎湖鳞伞多糖(PFPD)在50mg/kg的剂量时，脾脏指数的数据显示不显著，但在多糖的剂量为200mg/kg时，脾脏指数的数据显示有显著性差异。由此可知免疫抑制小鼠的脾脏指数随着PFPD浓度的增大而增大，甚至比正常小鼠的脾脏指数还大。以此说明鼎湖鳞伞多糖能使因环磷酰胺诱导产生的脾脏指数下降得以恢复，在一定程度上起到了提高机体免疫的能力。但与环磷酰胺模型组相比，三种不同剂量的鼎湖鳞伞多糖均对环磷酰胺引起的小鼠胸腺指数下降无拮抗作用。

表3 PFPD对小鼠脾脏和胸腺指数的影响Table 3 Effect of PFPD on the index of spleen and thymus

2.4 鼎湖鳞伞多糖对迟发型超敏反应的调节作用［18］及对血清中溶血素(HC50)的影响［19－20］

鼎湖鳞伞多糖对小鼠迟发型超敏反应(DTH)耳肿胀度的影响见表4中。

从表4中可以看出:环磷酰胺模型组和正常对照组相比，耳肿胀度显著性减少(p＜0.05)。说明环磷酰胺免疫抑制模型建模成功。而阳性药物组和不同剂量的鼎湖鳞伞多糖组处理，均显著地提高DTH的耳肿胀度(p＜0.05)，且这种变化与鼎湖鳞伞多糖呈现出剂量依赖关系。

鼎湖鳞伞多糖对小鼠血清中溶血素(HC50)的影响见表4所示:小鼠连续三天注射100mg/mL环磷酰胺后，其HC50值显著降低(p＜0.05)。说明环磷酰胺免疫抑制模型建模成功。阳性药物盐酸左旋咪唑组与环磷酰胺免疫抑制模型相比，可以显著地提高免疫小鼠体内溶血素水平(p＜0.05)。当PFPD浓度达到100mg/mL时，可以使小鼠血清中的溶血素水平提高，当PFPD浓度为200mg/mL时，小鼠血清中溶血素水平大于正常小鼠水平。实验结果表明:PFPD能有效提高免疫力低下小鼠的体内免疫功能。

表4 PFPD对小鼠耳肿胀度和血清溶血素的影响Table 4 Effect of PFPD on swelling rate of ear

2.5 鼎湖鳞伞粗多糖对小鼠血清中溶菌酶活性的调节作用

从图4中可以看出，环磷酰胺模型组与正常对照组相比，小鼠血清中的溶菌酶含量显著降低(p＜0.05)，表明环磷酰胺免疫抑制模型建模成功。三种不同剂量的鼎湖鳞伞粗多糖组与正常对照组和模型组相比，其血清中的溶菌酶含量极显著上升，且这种变化与剂量呈现一定的量效关系。

图4 PFPD对小鼠血清中溶菌酶活性的影响(U/mL)Fig.4 Effect of PFPD on activity of lysozyme in mice serum(U/mL)

2.6 鼎湖鳞伞粗多糖对小鼠脾脏中溶菌酶活性的调节作用

从图5可知:与正常对照组相比，环磷酰胺模型组脾脏中溶菌酶含量显著降低(p＜0.05)，表明环磷酰胺免疫抑制模型建模成功。小鼠腹腔注射不同剂量的鼎湖鳞伞多糖后，与正常对照组和模型组的小鼠相比，其脾脏中的溶菌酶含量极显著上升，且这种变化与剂量组呈现一定的量效关系。

图5 PFPD对小鼠脾脏中溶菌酶活性的影响Fig.5 Effect of PFPD on activity of lysozyme in mice spleen(U/mL)

3 结论

本实验表明:PFPD最佳的提取工艺条件为:提取温度为90℃，提取时间为6h，液料比为20mL/g，PFPD的得率为8.95%。腹腔注射环磷酰胺后，免疫抑制鼠免疫功能和正常对照组相比有所下降，但用不同剂量的PFPD处理后免疫抑制鼠的免疫能力有所提高。环磷酰胺模型组与正常对照组相比，脾脏和血清中溶菌酶含量显著降低(p＜0.05)，表明环磷酰胺免疫抑制模型建模成功。小鼠腹腔注射不同剂量的鼎湖鳞伞多糖后，与正常对照组和模型组的小鼠相比，其脾脏和血清中的溶菌酶含量均极显著上升，且这种变化与剂量组呈现一定的量效关系。本实验表明，PFPD具有明显的免疫调节活性，能提高免疫抑制鼠的非特异性免疫反应。由此得出鼎湖鳞伞粗多糖具有一定的体内免疫调节活性，是一种良好的免疫调节剂。

［1］田恩静.中国鳞伞属［Pholiota(Fr.)Kummer］真菌分类学研究［D］.长春:吉林农业大学，2005.

［2］田恩，图力古尔.中国鳞伞属(广义)已知种类及其分布［J］.菌物研究，2004，2(1):25－34.

［3］邢来君，李明春.普通真菌学［M］.北京:高等教育出版社，1999.

［4］林建松.论灵芝在中华历史文化中的影响［J］.中国食用菌，1998，17(6):4－5.

［5］周世文，徐传福.多糖的免疫药理作用［J］.中国生化药物杂志，1994，15(2):143－147.

［6］郑敏，王亚平.中药多糖杭肿瘤的药理学研究进展［J］.国外医学 .中医中药分册，2000，22(5):259－263.

［7］Cooyk Y，Rabinovich GA.protein－glycan interactions in the control of innate and adaptive immune responses［J］.Nat Immunol，2008，9(6):593－601.

［8］Guan R，Mariuzza RA.Peptidoglycan recognition proteins of the innate immune system［J］.Trends Microbiol，2007，15(3):127－134.

［9］Bertozzi CR，Kiessling LL.Chemical glycobiology［J］.Science，2001，291(5512):2357－2364.

［10］柯春林.兽疫链球菌荚膜多糖的制备、鉴定及生物活性的研究［D］.南京:南京农业大学，2009.

［11］郝志鹏，马丽杰，吴敬，等.海红果多糖提取工艺及体外抗氧化活性研究［J］.食品科学，2012，33(18):88－92.

［12］孔祥辉，张介驰，戴肖东，等.黑木耳多糖的提取与纯化［J］.生物技术，2005，15(1):81－82.

［13］秦小明.金针菇子实体多糖成分的初步研究［J］.食用菌学报，2005，12(2):27－31.

［14］杨铁虹.当归多糖的分离纯化与免疫作用及其作用机理的研究［D］.西安:第四军医大学，2003.

［15］张晨晓.泥鳅多糖的免疫调节和抗肿瘤作用机理［D］.武汉:华中科技大学，2005.

［16］王阳，王伯初，周菁，等.多糖的免疫调节功能研究进展［J］.重庆大学学报:自然科学版，2004，27(3):104－107/113.

［17］陈慰峰.医学免疫学［M］.北京:人民卫生出版社，2000.

［18］陈向涛.复方中药玉屏风多糖的免疫调节作用及其机理的研究［D］.合肥:安徽医科大学，2006.

［19］周光炎.免疫学原理［M］.上海:上海科技出版社，2000.

［20］龚非力.医学免疫学［M］.北京:北京科学出版社，2003.