动物园初生珍禽禽流感、新城疫母源抗体检测及免疫程序研究

李兴玉 ，王 强 ，林 毅 ，邓家波 ，廖党金 *，牛李丽

（1.四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066；2.成都市动物园＆成都野生动物研究所，四川 成都 610081）

禽流感病毒广泛存在于世界范围内的家禽和鸟体内，野生水禽被认为是禽流感病毒主要的自然储存宿主。近十年来，已有研究报道高致病性禽流感可引起野生黑天鹅、斑头雁、棕头鸥发病死亡，并从野生鸟类中分离出高致病性H5N1病毒。新城疫病毒同样在世界范围内的家禽和多种鸟类身上存在可造成家禽感染发病死亡，多种野鸟被认为是新城疫病毒的自然储存库。成都动物园目前有百鸟苑、鹦鹉馆、水禽湖等，饲养着孔雀、黑天鹅等多种珍禽。动物园每年都有一定数量的初生珍禽孵出，因此做好雏禽禽流感、新城疫等重要疫病的免疫预防对于珍禽的繁育工作具有重要意义。但是，目前动物园尚未建立起一套针对初生珍禽的免疫程序，国内外可以借鉴的此类研究非常有限，因此，本项目组采集了初生珍禽的血清用于测定母源抗体，并对所测数据进行分析，以建立一套适合初生珍禽的免疫程序。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 成都动物园圈养的孔雀、绿头鸭等6种初生珍禽。

1.1.2 试验疫苗 禽流感(H5+H9)二价灭活疫苗：哈维科生物技术公司生产；鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗（LaSota株 +M41株）：齐鲁动物保健有限公司生产；鸡新城疫弱毒活疫苗（LaSota株）：哈维科生物技术公司生产。

1.1.3 检测试剂 H5亚型禽流感抗原、阳性血清和H9亚型禽流感抗原、阳性血清，均购自哈尔滨维科生物技术开发公司；鸡新城疫血凝抑制试验抗原、阳性血清，购自青岛易邦生物工程公司。

1.1.4 1%红细胞悬液 采集3只无禽流感、新城疫抗体的青年健康公鸡血液与等体积的阿氏液混合，用pH值为7.2的0.01mol/L PBS液离心洗涤3次，然后用该PBS液配成体积分数为1%的红细胞悬液。

1.2 方法

1.2.1 免疫 采用胸部肌肉或皮下注射的方法同时免疫禽流感（H5+H9）二价灭活疫苗、新城疫-传染性支气管炎二联灭活疫苗，免疫剂量为0.3～0.5mL/羽；同时用2头份/羽的免疫剂量滴鼻免疫鸡新城疫弱毒活疫苗（LaSota株）。

1.2.2 血清采集 15日龄以下的初生珍禽在心脏采血，其余珍禽在翅静脉采血，待血清析出后，8 000 r/min离心4min，吸出血清并编号，－20℃冰箱中保存，备用。

1.2.3 抗体检测 参照《高致病性禽流感诊断技术》（GB/T 18936-2003)和《新城疫诊断技术》（GB/T 16550-2008)标准，采用血凝抑制试验方法检测血清中的禽流感、新城疫抗体。

1.2.4 结果判定 以完全抑制4个血凝单位抗原的血清最高稀释倍数作为HI效价，只有阴性对照孔效价不大于2log2，阳性对照孔误差不超过1个log2，试验结果才有效。

2 结果与分析

2.1 初生珍禽母源抗体的检测结果 在2012年雏禽的出孵季节，采集了15日龄左右初生珍禽的9份血清进行母源抗体测定，检测结果见表1。表1显示6种初生珍禽的禽流感、新城疫母源抗体较好，其中白冠长尾雉、孔雀、白鹇、蓝鹇的母源抗体基本在5log2以上，绿头鸭的禽流感母源抗体较差，但也在4log2以上，未免疫成年大雁所产的雏雁也检出了低效价的母源抗体。

表1 初生珍禽母源抗体测定结果log2

母源抗体虽然能使幼禽抵御感染获得被动性免疫保护，但却可能干扰疫苗（特别是弱毒苗）对雏禽的免疫效果，因此确定雏禽的首免日龄很关键。一般选择雏禽的母源抗体达到免疫保护临界值时对雏禽进行首免，这样既可使雏禽获得母源抗体的保护，又可减少母源抗体对免疫效果的干扰。分析近年来家禽及孔雀、鸵鸟等雏禽禽流感、新城疫母源抗体的消长规律，可知雏禽的免疫抗体在10日龄内达高峰以后随着日龄增加母源抗体逐渐消失。母源抗体的消失时间与母源抗体的基础水平呈正相关，即母源抗体基础水平越高，则消失时间越长。不同品种的雏禽，其母源抗体半衰期有差异，但一般为4d左右下降一个滴度。本次试验参照家禽禽流感、新城疫免疫程序，初步建立了初生珍禽的免疫程序：15日龄首免，首免后1个月加强免疫1次。

2.2 初生珍禽免疫后对AI、ND抗体的测定 为了检测上述免疫程序的免疫效果，在加强免疫后1个月采集了白冠长尾雉等5种初生珍禽的25份血清进行了免疫抗体检测，结果见表2。

表2 初生珍禽免疫后的抗体检测结果

上述初生珍禽的免疫抗体检测结果显示：初生珍禽产生了较好的免疫抗体，白冠长尾雉、孔雀等种珍禽群体在加免后1个月，禽流感H5、H9亚型的HI抗体几何平均值分别为7.6log2、7.2log2，免疫合格率分别为100%、84%，白冠长尾雉、孔雀、白鹇3种幼禽的新城疫抗体几何平均值为7.18log2，免疫合格率达94.12%。

3 结论及分析

由于珍禽价值昂贵，数量较少，采样难度大，特别是初生珍禽的采样难度更大，部分初生珍禽甚至在前期采血过程中即死亡，因此本试验仅检测了9日龄左右初生珍禽的母源抗体效价，未能测定初生珍禽母源抗体的消长规律，而主要参照了家禽及孔雀、鸵鸟等相关禽类母源抗体的消长规律，以此来建立初生珍禽的免疫程序。为了检测该免疫程序的免疫效果，在雏禽加免后1个月笔者又进行了免疫抗体测定，其结果显示：所免疫的5种珍禽的禽流感免疫抗体几何平均值都超过了5log2；免疫的3种珍禽的新城疫免疫抗体几何平均值超过了6log2，均超过了农业部禽流感、新城疫免疫监测方案中“禽流感免疫抗体效价应≥4log2，新城疫免疫抗体效价应≥5log2，免疫合格率≥70%”的标准。说明所建立的初生珍禽禽流感、新城疫的免疫程序比较合理，这对于国内动物园建立初生珍禽免疫程序具有重要的借鉴意义。

参与文献：

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