嗜热菌Thermaerobacter subterraneus DSM13965磷酸三酯酶的原核表达、纯化及性质表征

林禹欣,刘惠麟,韩葳葳,詹冬玲,刘景圣

(1.吉林农业大学 食品科学与工程学院,长春 130118；2.吉林大学 分子酶学工程教育部重点实验室,长春 130012)

有机磷农药常被用作杀虫剂喷洒在果树和蔬菜上,主要通过与胆碱酯酶的活性内羟基结合抑制酶活性,使其失去分解乙酰胆碱的能力,导致乙酰胆碱的积累[1].

磷酸三酯酶(phosphotriesterase,PTE,EC31118)是降解有机磷毒剂的主要酶类,可与水果蔬菜表面残留的农药发生化学反应,破坏有毒成分的化学结构,使其变为无毒、可溶于水的小分子物质[2-4].

嗜热酶具有较高的热稳定性和高抗性[5-7].嗜热磷酸三酯酶由于具有较高的热稳定性及可溶性而使其在实际应用中潜力较大.目前发现的嗜热磷酸三酯酶主要包括嗜热菌Deinococcusradiodurans来源的磷酸三酯酶(Dr-OPH)、超嗜热菌Sulfololussolfataricus来源的磷酸三酯酶(SsoPox)和嗜热菌Geobacilluskaustophilus来源的磷酸三酯酶[2].

本文通过克隆ThermaerobactersubterraneusDSM13965的磷酸三酯酶(PTE)基因,用双酶切将其与质粒pET15b连接,转化入大肠杆菌BL21中进行诱导表达,利用His抗体鉴定目标蛋白,并研究重组蛋白(DSM-PTE)的酶学性质.

1 材料与方法

1.1 材 料

嗜热菌T.subterraneusDSM13965购自德国菌种保藏中心；大肠杆菌BL21及质粒pET15b为美国Invitrogen公司产品；DNA快速提取试剂盒和DNA胶回收试剂盒购自杭州维特洁生化技术有限公司；限制性内切酶、T4-DNA连接酶及琼脂糖为荷兰Boehringer Mannheim公司产品；其他试剂均为美国Sigma公司产品.由上海生物工程有限公司对引物进行合成和测序.

1.2 方 法

1.2.1 同源序列比对 分别将T.subterraneusDSM13965的有机磷水解酶、来自G.KaustophilusHTA426的磷酸三酯酶、来自S.solfataricus的内酯酶/磷酸三酯酶和来自D.Radiodurans的有机磷水解酶进行同源序列比对.

1.2.2 嗜热菌T.subterraneusDSM13965基因组DNA的调取 按细菌基因组DNA提取试剂盒(TIAGEN)说明提取TS基因组DNA,用质量分数为0.8%的凝胶电泳检测基因组DNA的纯度和浓度,分装后于-40 ℃保存备用.

PCR反应条件：95 ℃预变性5 min,95 ℃变性1 min,58 ℃退火1 min,72 ℃延伸10 min,循环30次,72 ℃延伸20 min.通过质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,目的基因片段于-20 ℃保存.

1.2.4 磷酸三酯酶基因表达质粒的构建 由DNA胶回收试剂盒回收PCR产物,将PCR产物连接至pET-15b上,转化入E.coliXL中.将筛选到含PTE的阳性克隆进行双酶切和序列分析.对阳性克隆和质粒pET-15b分别进行NdeⅠ和BamHⅠ双酶切,将酶切得到的目的基因与双酶切后载体pET-15b相连.连接反应体系为:T4 DNA连接酶0.3 μL,T4 DNA连接酶缓冲液1.2 μL,双酶切后的载体pET-15b 1.5 μL,双酶切后的目的基因片段7 μL.

将反应物置于16 ℃金属浴中连接过夜,连接产物转化至感受态E.coliBL21中.挑取单菌落,培养并提取质粒,通过PCR对重组质粒进行筛选和序列分析.

1.2.5 目的基因的诱导表达及产物纯化 将工程菌接种于含100 μg/mL氨苄青霉素(AMP)的10 mL Luria-Bertani(LB)液体培养基中,于37 ℃振荡培养过夜,再按照质量分数的1%接种量接种于100 mL LB液体培养基中,相同条件下培养至A600=0.6～0.8,加入异丙基-β-D-硫代砒喃半乳糖苷(IPTG,终浓度为0.3 mmol/L),30 ℃诱导培养过夜.于4 ℃,6 000 r/min离心收集菌体,并悬浮于50 mmol/L pH=7.5的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液中,在冰浴中超声裂菌,60 ℃热处理30 min,离心,弃沉淀,上清液经镍柱纯化,收集蛋白峰.融合蛋白部分经聚乙二醇(10 000)浓缩后,检测酶活.

1.2.6 磷酸三酯酶鉴定 用SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定纯化后得到的目标蛋白[8-9].通过质量分数为5%的浓缩胶和质量分数为10%的分离胶变性蛋白电泳进行检测.

1.2.7 磷酸三酯酶的活力测定 以甲基对氧磷(methyl-paraoxon)为底物,通过分光光度计测定磷酸三酯酶活力.监测水解产物对硝基酚在405 nm随时间变化的光吸收值,反应体系为2 mL,缓冲体系为50 mmol/L磷酸缓冲液(pH=7.5),甲基对氧磷的终浓度为0.1 mmol/L,加入适量的酶,70 ℃反应20 min,用T6紫外-可见分光光度计测定单位时间内的光吸收值,以不加入酶的体系作为空白对照.1个酶活力单位为每20 min催化水解1 μmol底物所需的酶量.酶比活计算公式如下：

其中:Δ OD405为反应时间内405 nm处光吸收强度的变化值；V1为反应体系 (2 mL)；ε为消光系数(0.016(μmol/L)-1)；t为反应时间(min)；V2为加入的酶量(mL)；ρ为酶的质量浓度(mg/mL).每次做3个平行实验,取平均值.

1.2.8 最适pH值及温度的测定 分别以三羟甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)、2-吗啉乙磺酸(MES)、3-(环己胺)-1-丙磺酸(CAPS)和4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)配制不同pH值的缓冲液,酶活性测定方法同1.2.7.在pH=4～11内检测酶活力,最高酶活力设为100%,以相对活性为纵坐标对pH值做图,求得最适pH值.

在30～90 ℃内测定融合蛋白的磷酸三酯酶活力,观察温度对酶活性的影响.最高酶活性设为100%,以相对活性为纵坐标对温度做图,求得最适温度.

1.2.9 热稳定性测定 将PTE纯化酶液置于70 ℃水浴中,用石蜡油封顶,每间隔1 h取一次酶液进行活力测定.磷酸三酯酶活力测定同1.2.7.

2 结果与讨论

2.1 同源序列比对结果

通过NCBI的protein blast检索发现,与DSM-PTE同源性高的蛋白主要都是有机磷水解酶.将已知结构的有机磷水解酶[10-11]和DSM-PTE进行同源序列比对,结果如图1所示.

DSM为T.subterraneus DSM13965的有机磷水解酶(同源性99%)；3ORW为G.kaustophilus HTA426的磷酸三酯酶(同源性62%)；2VC5为S.solfataricus的内酯酶/磷酸三酯酶 (同源性35%)；3GU1为D.radiodurans的磷酸三酯酶(同源性61%).图 1 DSM-PTE同源序列比对Fig.1 Sequence alignment of DSM-PTE with other members

由图1可见,其同源性均大于35%,推测DSM-PTE具有有机磷水解酶的活性.

2.2 磷酸三酯酶表达质粒的构建

TS基因组的调取结果如图2所示.由图2可见,TS基因组提取准确,以其为模板进行PCR扩增，结果如图3所示.由图3可见,目的片段(约1 000 bp)成功插入,与预期大小一致,序列测定结果表明,所获目的基因正确.

2.3 重组蛋白DSM-PTE的表达与纯化

用SDS-PAGE检验纯化蛋白组分,结果如图4所示.由图4的第2条带可见,重组蛋白的相对分子量为50 000,主要以二聚体形式存在.由Western-blot(第3条带)的免疫印迹可见,重组蛋白DSM-PTE是约为50 000的大分子化合物.与文献[12]结果相符,PTE在溶液中主要以单体和二聚体的形式存在.

图2 TS基因组的调取 图3 磷酸三酯酶基因的调取 图4 PTE蛋白纯化电泳 Fig.2 Extraction of TS genome Fig.3 Extraction of PTE gene Fig.4 SDS-PAGE of purified PTE

2.4 最适温度与pH值

本文以甲基对氧磷为底物,利用分光光度计测定磷酸三酯酶的活力.温度和pH值的相对活力曲线如图5所示.由图5(A)可见,在70～90 ℃内,酶的相对活力均大于50%,其最适温度为70 ℃；在30～60 ℃内,酶的相对活力均低于50%.表明异源表达的磷酸三酯酶是对温度敏感的高温酶.

图5 磷酸三酯酶的最适温度(A)和pH值(B)Fig.5 Optimal temperature (A) and pH (B) of PTE

在70 ℃,TAPS,MES,CAPS和HEPES的缓冲液中,以甲基对氧磷作为底物,在pH=4.0～11.0内检测磷酸三酯酶酶活力.由图5(B)可见,酶相对活力最高的pH=10.0.当pH=7.0～11.0时,酶的相对活力均大于50%,当pH=4.0～6.0时,酶的相对活力低于40%,表明重组磷酸三酯酶适合中性偏碱的环境,是一种典型的碱性磷酸水解酶.

2.5 热稳定性

磷酸三酯酶在70 ℃的相对活力与时间变化关系如图6所示.由图6可见,DSM-PTE具有较好的热稳定性.工程菌分泌的磷酸三酯酶PTE主要以二聚体形式存在,酶活力随时间的增加而逐渐减弱,这是因为二聚体解聚至无活力的单体所致,其半衰期为1 h.

图6 PTE的热稳定性Fig.6 Thermal stability of PTE

综上所述,嗜热菌T.subterraneusDSM13965的磷酸水解酶基因编码产物主要以二聚体的形式存在,并具有磷酸三酯酶的活性,在高温下有良好的稳定性.

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