虎杖灌胃大鼠血尿中蒽醌类代谢物的LC-MS分析

康 威,沈咏梅,邓巧虹,余辉攀,林青华,张宏桂

(1.北京中医药大学 中药学院,北京 100102;2.吉林大学 白求恩医科大学制药厂,长春 130012)

中药虎杖系蓼科蓼属植物虎杖(PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc.)的根茎和根[1],具有祛风利湿、散瘀定痛和止咳化痰的功效,主要含有蒽醌类化合物.目前已有的研究均利用高效液相色谱(HPLC)法测定血清或血浆等生物样品中的蒽醌类成分,由于代谢物成分较复杂,因此干扰较多[2].液相色谱-电喷雾串联质谱(LC-MS)方法多用于单一成分试药的代谢产物鉴定[3-4],本文以中药样品中蒽醌类代谢物的LC-MS分析为例,探讨复杂样品中某一成分代谢产物结构是否因多成分共存而改变,并建立LC-MS法测定大鼠灌胃虎杖提取物后的血浆和尿液中主要代谢产物的方法.

1 实 验

1.1 仪器与药品

Agilent 1100系列液质联用仪；Agilent LC/MSD Trap XCT Plus型质谱;二极管阵列检测器;高压二元梯度泵;自动进样器;ChemStations工作站.

大黄素甲醚、大黄酚大黄素和芦荟大黄素购自中国食品药品检定研究院；色谱级甲醇；水为二次蒸馏水并经0.45 μm滤膜过滤;虎杖提取物为自制;Wistar大鼠由北京中医药大学实验动物中心提供.

1.2 方 法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent XDB-C18(4.6mm×250 mm,5 μm),柱温为室温(25 ℃)；流动相见表1；检测波长：254 nm；进样量：20 μL.

表1 甲醇-水线性梯度洗脱流动相Table 1 Linear gradient elution mobile phase of methanol-water

1.2.2 质谱条件 电喷雾离子源,离子源温度350 ℃,毛细管电压3.5 kV,雾化压力275.8 kPa,干燥氮气流速10 L/min,质谱扫描范围m/z50～750,负离子检出模式.

1.2.3 化学对照品溶液配置 称取适量大黄酚、大黄素甲醚、大黄素和芦荟大黄素对照品,置于50 mL 量瓶中,用甲醇定容,摇匀,得上述4种标准品的混合液.

1.2.4 大鼠血浆样品的采集及处理 取健康雄性Wistar大鼠6只,平均210 g,置于代谢笼中,给药前禁食,可自由饮水12 h.用虎杖提取物水溶液灌胃,给药剂量为200 mg/kg.大鼠灌胃后,分别于1,3,6,12,24 h由大鼠眼底静脉丛取血,置于1 mL肝素化的离心管中,以3 000 r/min离心10 min,取上清液即得血浆样品.用甲醇和水各3 mL依次活化Cleanert C18SPE固相萃取柱,上样3 mL,用2 mL水洗脱,再用2 mL甲醇洗脱,甲醇液经0.45 μm滤膜过滤后用于LC-MS分析.

1.2.5 大鼠尿液的采集与处理 取健康雄性Wistar大鼠6只,给药前禁食,可自由饮水12 h.取虎杖提取物,用质量分数为0.5%的羧甲基纤维素钠制成混悬液,按200 mg/kg灌胃给药,分别收集1,3,6,12,24 h的尿液.尿液经0.45 μm滤膜过滤后萃取.用甲醇和水各3 mL依次活化Cleanert C18 SPE固相萃取柱,上样3 mL,用2 mL水洗脱,再用2 mL甲醇洗脱,甲醇液用于LC-MS分析.

2 结 果

2.1 血浆样品中蒽醌代谢产物的结构分析

6 h血浆样品经LC-MS测定所得总离子流如图1所示.分析图1中的峰1可得其MS2碎片离子如图2所示.由图2可见,其一级谱的基峰m/z269[M-H],并出现强峰m/z187和弱峰m/z225.与大黄素HPLC保留时间(46 min)及其质谱碎片离子比较[2],鉴定其为大黄素.

24 h血浆样品经LC-MS测定所得总离子流如图3所示.分析图3中的峰2可得其MS2碎片离子如图4所示.由图4可见,其一级质谱基峰为m/z253[M-H],并出现强峰m/z187和弱峰m/z87.与大黄酚HPLC保留时间(48 min)及其质谱碎片离子比较[2],鉴定其为大黄酚.分析图3中的峰3可得其MS2碎片离子如图5所示.由图5可见,其一级质谱基峰为m/z283[M-H],并出现较强峰m/z175和m/z113.与大黄素甲醚的HPLC保留时间(53 min)及其质谱碎片离子比较[5],鉴定其为大黄素甲醚.

图1 6 h血浆样品总离子流Fig.1 Total ion chromatogram of the plasma sample collected at 6 h after the last administration

图2 图1中峰1的MS2碎片离子Fig.2 MS2 of the fraction of peak 1 from Fig.1

图3 24 h血浆样品总离子流Fig.3 Total ion chromatogram of the plasma sample collected at 24 h after the last administration

图4 图3中峰2的碎片离子Fig.4 MS2 of the fraction of peak 2 from Fig.3

图5 图3中峰3的碎片离子Fig.5 MS2 of the fraction of peak 3 from Fig.3

2.2 尿液试样蒽醌代谢产物结构分析

对尿液样品进行LC-MS检测,共检测到4种代谢产物,其碎片离子如图6所示.

(A) 大黄素葡萄糖醛酸结合物一级质谱;(B) 大黄素葡萄糖醛酸结合物二级质谱;(C) 大黄素质谱;

由图6可见: 第一种蒽醌代谢产物的准分子离子峰m/z为445,比m/z269增加了176个质量单位,具有典型的葡萄糖醛酸化代谢途径的质谱特征[6],因此推测该蒽醌代谢产物为大黄素的葡萄糖醛酸结合物;第二种蒽醌代谢产物的分子量为270,与对照品比较鉴定为大黄素[5];第三种蒽醌代谢产物准分子离子峰m/z为365,与对照品芦荟大黄素结构碎片比较,判断该代谢产物可能为芦荟大黄素的磺酸化结合物[6];第四种代谢产物准分子离子峰的m/z为462,推断其可能为芦荟大黄素的葡萄糖醛酸结合物[6].

3 讨 论

1) 在虎杖提取物以多种成分给药的条件下,本文鉴定的蒽醌类化合物与单一蒽醌化合物给药具有相同的代谢产物[6],表明虎杖提取物其他成分对这些蒽醌化合物在大鼠体内的代谢未构成干扰；

2) 虎杖蒽醌类提取物在大鼠体内的代谢产物主要以大黄素原形物和葡萄糖醛酸结合物及硫酸酯缀合物的形式存在;

3) 利用本文方法对血浆和尿液中的代谢产物进行检测时,质谱可给出较多的碎片离子,有利于确定代谢产物的结构.

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