银杏内酯B对体外培养神经细胞延迟整流钾电流的作用

姚阳，刘坤，杨宇，吴敏范，张丽艳，梁宇

（沈阳医学院1.生理学教研室；2.病理生理学教研室；3.2011级临床医学系，沈阳 110034）

银杏内酯为银杏叶提取物中的萜类化合物，分为银杏内酯A、B、C、M、J和白果内酯。银杏内酯B是其有效成分，药理作用广泛，具有拮抗血小板活化因子、保护缺血损伤、抗炎、抗休克、促进神经可塑性和学习记忆能力等作用，对治疗心脑血管疾病具有较好的疗效［1］。钾通道是人体内分布最广、种类最多的一种离子通道，钾通道在细胞分子水平对于维持神经元的静息电位、延长动作电位的时程、改变细胞放电的频率等有重要作用。现已发现钾通道功能异常可能与多种神经系统疾病密切相关，如阿尔茨海默病、癫痫、帕金森病等［2］。延迟整流钾电流（delayed rectifier potassium current，IK）是电压依赖性钾电流的主要组成部分，是构成动作电位复极的主要电流，与细胞动作电位的时程和兴奋性密切相关［3］。人神经母细胞瘤细胞SH⁃SY5Y是一种经常用来研究神经保护作用的细胞系，由于其本身的特点常常用于建立神经元损伤模型和神经保护剂的筛选。本研究应用全细胞膜片钳技术记录SH⁃SY5Y细胞的电活动，探讨银杏内酯B对体外培养神经细胞IK的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

银杏内酯B（中国医科大学提取惠赠）；二甲亚砜、DMEM/F12、HEPES（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；胰蛋白酶（美国Sigma公司）；倒置显微镜（日本Olympus）；Axopatch200B放大器、数模转换器（美国Axon Instrument）。

1.2 方法

1.2.1 SH⁃SY5Y细胞的培养：应用DMEM培养基添加体积分数15%的胎牛血清培养细胞，每2～3 d换液1次，待细胞增长至80%融合时，胰酶消化细胞后，加含血清培养基终止反应。用滴管吹打使其成为单细胞悬液，滴加到铺有盖玻片的培养皿中传代［4］。

1.2.2 主要溶液配制：电极内液（mmol/L）：K⁃Aspartate 50，KCl 20，HEPES 20，EGTA 1，MgCl21，CaCl20.2，NaCl 13.6，K2ATP33，KOH 调至 pH7.4。细胞外液（mmol/L）：NaCl 135，KCl 5.4，MgCl21.0，NaH2PO40.33，HEPES 10，Glucose 5.5，用 NaOH 调至 pH7.4。银杏内酯B灌流液（μmol/L）：将银杏内酯B溶解于二甲亚砜中，用细胞外液稀释为0.1、1.0和10.0 μmol/L的灌流液。

1.2.3 膜片钳技术记录IK：将铺有SH⁃SY5Y细胞的盖玻片置于显微镜上方的浴槽内。用两步法拉制微电极，电极的电阻约为2～5 MΩ。在Vclamp模式下，设定保持电位为-80 mV，以10 mV为步阶，使膜电位由-60 mV逐步去极化至+60 mV，持续时间300 ms，记录外向电压依赖性钾电流［5］。先用细胞外液灌流细胞记录电压依赖性钾电流作为对照组，再分别用浓度为0.1、1.0和10.0 μmol/L银杏内酯B灌流持续灌流细胞，记录不同浓度银杏内酯B对电压依赖性钾电流的影响。

1.3 统计学分析

所有数据用pClamp10.0软件和SPSS 12.0统计学软件进行处理，结果以±s表示，组间比较用独立样本t检验。P＆lt;0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 银杏内酯B对IK峰值的影响

IK为最后100 ms激发出的外向钾电流的主要成分。用pClamp10.0计算出每个细胞的电容，电流值与电容之比为电流密度（pA/pF）。以记录时间为横轴，记录的电流为纵轴，绘制电流图（图1）。可以看出加入银杏内酯B后与正常对照相比，IK明显增强。用0.1、1.0和10.0 μmol/L银杏内酯B灌流细胞，在指令电压为+60 mV时IK峰密度值分别从（2.19±0.45）pA/pF增大至（2.48±0.37）pA/pF（P＆lt;0.05，n=5）、（2.97±0.29）pA/pF（P＆lt;0.01，n=5）、（3.15±0.48）pA/pF（P＆lt;0.01，n=5）。IK分别增大13.24%、35.62%和43.85%，具有浓度依赖性。

图1 GB对SH⁃SY5Y细胞IK的影响Fig.1 Effect of GB perfusate on IKin SH⁃SY5Y cells

2.2 银杏内酯B对延迟整流钾的电流—电压（I⁃V）曲线的影响

以各命令电压下的平均电流密度值（pA/pF）对相应的膜电位（mV）作图，制得I⁃V曲线（图2）。结果显示，从-60～-30 mV范围内各组I⁃V曲线基本重合，但是从-20 mV开始加入银杏内酯B后的IK开始升高，并且随着进一步的去极化升高幅度逐渐增大，电压达到40～60 mV时增大速度明显加快。

图2 GB对SH⁃SY5Y细胞IK I⁃V曲线的影响Fig.2 Effect of GB perfusion on I⁃V curve of IK in SH⁃SY5Y cells

3 讨论

钾通道在中枢神经系统中广泛存在，具有调节神经元膜电位和兴奋性的作用。在神经元去极化后，钾通道开放使其复极化，并有助于使膜电位稳定在低于促发动作电位的阈值以下，使细胞具有兴奋性。本研究应用全细胞膜片钳技术记录SH⁃SY5Y细胞的电活动，实验结果显示应用银杏内酯B后SH⁃SY5Y细胞的IK电流明显增强，并呈浓度依赖性。说明银杏内酯B具有开放延迟整流钾通道的作用。

银杏内酯对中枢神经系统多种疾病有一定的防治作用，保护脑缺血，减少再灌注损伤，抗阿尔茨海默病。研究［6］表明银杏内酯B（1 μmol/L）可抑制下丘脑室旁核神经元的自发放电，也可抑制由L⁃谷氨酸诱发的神经元放电。但是加入广泛钾通道阻断剂四乙基胺后，这种抑制效应被完全阻断。说明银杏内酯B抑制放电的原因可能是与其开放钾通道、增大钾电流有关。延迟整流型钾通道开放可能是钾电流增大的机制。作者认为银杏内酯B是通过降低神经元活动而发挥一定程度的保护作用。

β⁃淀粉样蛋白诱导的神经细胞毒性反应是阿尔茨海默病的重要病理机制之一。研究表明将β⁃淀粉样蛋白作用于新生大鼠海马神经元，可明显抑制电压依赖性快失活钾离子电流，而钾电流下降直接导致胞内钙离子水平上升超出正常状态下神经元去极化时的水平，即可产生神经毒性。这一反应在去除β⁃淀粉样蛋白后可逆转［7］。另有研究将Aβ1⁃42作用于胆碱能神经元，用全细胞膜片钳记录IK和瞬时外向钾电流（IA），Aβ1⁃42可使IK降低（20.08±1.86）%，使IA降低（20.4±4.6）%［8］。这些研究说明银杏内酯B可以降低β⁃淀粉样蛋白引起的神经毒性反应。目前认为银杏内酯B具有神经保护功能、抗阿尔茨海默病的作用，该作用可能与银杏内酯B增大IK电流、降低神经元活动有关。

［1］汪素娟，康安，狄留庆，等.银杏叶提取物主要活性成分药动学研究进展［J］.中草药，2013，11（8）：983-985.

［2］Wang YP，Li XT，Liu SJ，et al.Melatonin ameliorated okadaic⁃acid induced Alzheimer⁃like lesions［J］.Acat Pharmacol Sin，2004，25（3）：276-280.

［3］Zhan XQ，He YL，Yao JJ，et al.The antidepressant citalopram inhib⁃its delayed rectifier outword K+current in mouse cortical neurons［J］.J Neurosci Res，2012，90（10）：324-336.

［4］郭凤，姚阳，孙威，等.无镁诱导培养大鼠海马神经元与SH⁃SY5Y细胞自发性放电的变化［J］.中国医科大学学报，2012，41（7）：577-579.

［5］郭凤，孙威，姚阳，等.无镁诱导培养大鼠海马神经元癫痫放电模型中延迟整流钾电流的变化［J］.中国医科大学学报，2011，40（3）：193-195.

［6］Lin Y，Wang R，Wang X，et al.Effect of ginkgolide B on neuronal discharges in paraventricular nucleus of rat hypothalamic slices［J］.Neurosci Bull，2008，24（6）：345-350.

［7］Yu SP，Farhangrazi ZS，Ying HS，et al.Enhancement of outward po⁃tassium current may participate in beta⁃amyloid peptide induced cortical neuronal death［J］.Neuronal Dis，1998，5（2）：81-84.

［8］Alie K，Ma L，Yang J，et al.Aβ inhibition of ionic conductance in mouse basal forebrain neurons is dependent upon the cellular prion protein PrPC［J］.J Neurosci，2011，31（45）：16292-16297.